DNMT3B对人脐带间质干细胞成骨分化能力的影响

目的研究DNA甲基化转移酶3B(DNA methyltransferase 3B,DNMT3B)调控人脐带间质干细胞骨生成的作用。方法利用RNA干扰法获得两株DNMT3B基因低表达的人脐带间质干细胞(Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells,hUMSCs)。在使用qPCR和免疫组织化学法确定DNMT3B表达缺失后,对hUMSCs进行骨生成定向诱导分化。并利用免疫组织化学法和茜素红染色评价突变型和野生型hUMSCs成骨能力差异。结果由RNA干扰获得的两株突变型hUMSCs中两株突变型中DNMT3B表达量分别下降至野生型hUMSCs的12.67±0.45%和35.60±0.76%(P<0.05)。而在DNMT3B突变型hUMSCs中间质干细胞标记物CD73和CD90基因mRNA的表达水平也分别下降(P<0.05)。CD73水平分别是野生型细胞的15.83±0.44%和16.60±0.37%(P<0.05);CD90的水平分别是野生型细胞的35.23±0.30%和58.64±0.71%(P<0.05)。在骨生成过程中,免疫组化染色后镜下比较显示DNMT3B突变型的细胞表达Osteocalcin较正常细胞低,qPCR结果表明RUNX2,IBSP和ALPL基因的mRNA表达量水平较正常细胞均明显下降(P<0.01),其中shD3B-1和shD3B-2的RUNX2基因表达水平分别为正常细胞的55.09±0.53%和53.77±0.47%(P<0.01);IBSP基因表达水平分别为正常细胞的53.21±0.81%和41.75±0.44%(P<0.01);ALPL基因表达水平分别为正常细胞的15.55±0.10%和17.86±24%(P<0.01)。同时茜素红染色检测也显示其成骨后细胞成骨功能减弱。结论 DNMT3B突变或缺失会导致hUMSCs骨生成能力下降。     

Expression of cancer stem cell-associated markers in liver cancer cell lines HepG2 and Hep3B

目的 富集培养肝癌干细胞,研究肝癌干细胞相关标志物CD90、CD133、八聚体4(Oct4)和ATP结合盒转运蛋白ABCG2在肝癌细胞HepG2、Hep3B中的表达,并初步分析其意义.方法 使用流式细胞仪从肝癌细胞(检测HepG2、Hep3B两种细胞系)中分选肝癌干细胞并行无血清成球培养.设肝癌细胞组为对照组.单细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力.分别给予肝癌细胞及肝癌下细胞阿霉素处理,MTT法测阿霉素处理后各组细胞的存活率,Real-time PCR及Western blot分别检测各组细胞CD90、CD133、Oct4和ABCG2 mRNA及蛋白水平的表达.结果 肝癌干细胞单个细胞增殖能力强于肝癌细胞,克隆形成分析显示培养第14天克隆形成率Hep3B细胞组低于Hep3B CSCs组[8/27(30％)vs 12/23(52％),P＜0.05 ];HepG2细胞组克隆形成率也低于HepG2CSCs组[7/38(18％)vs 9/26(35％),P＜0.05].用阿霉素处理肝癌细胞及肝癌干细胞48 h后,MTT法测定结果显示肝癌干细胞组细胞活性显著高于对照组(P ＜0.05):HepG2细胞组细胞活性为(38.17 ±6.92)％、HepG2CSCs组为(69.88±5.43)％;Hep3B细胞组(50.16±4.89)％,Hep3B CSCs组为(78.53±7.86)％.Real-time PCR结果显示肝癌干细胞组中CD90、CD133、Oct4及ABCG2基因mRNA表达较亲代细胞组显著上调(P＜0.05).Western blot结果显示肝癌干细胞组Oct4及ABCG2蛋白水平显著上调,与亲代细胞组间表达差异有显著性(P＜0.05).结论 肝癌干细胞相关标志CD90、CD133、Oct4及ABCG2均高表达于肝癌干细胞,并且Oct4及ABCG2基因的高表达有可能与肝癌干细胞耐药性相关.     

肝癌细胞系中DNMTs表达的检测及意义

目的:检测HBV相关肝癌细胞系(Hep3B)与非HBV相关肝癌细胞系(HepG2)中甲基化转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)的表达,分析HBV感染与DNMT表达之间的关系。方法:应用荧光定量PCR(Flurescencequantitative-PCR,FQ-PCR)检测两种肝癌细胞系中DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、GAPDH基因mRNA表达水平,并将DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B表达水平与参比基因进行比较。结果:DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B在HBV相关细胞系Hep3B中表达分别为:1.26±0.15、0.76±0.15、1.26±0.20、0.66±0.13;在非HBV相关肝癌细胞系HepG2中的表达分别为:0.64±0.11、0.62±0.12、0.48±0.12、0.36±0.10。Hep3B细胞系中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达均高于HepG2(P均<0.01)。结论:⑴HBV相关肝癌细胞系Hep3B中存在DNMT过表达;⑵HBV感染可能刺激DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达,进而促进抑癌基因甲基化。     

多基因启动子甲基化参与的乳腺癌MCF-7对他莫昔芬敏感性探究

目的 探讨多基因启动子甲基化参与的乳腺癌MCF-7对他莫昔芬敏感性的关系.方法 用MTT法对比乳腺癌MCF-7细胞株与耐药株生长增殖差异;流式细胞检测亲本与耐药株细胞凋亡之间的差异;RT-PCR及Real-Time PCR对比两细胞株相关基因mRNA表达差异;甲基化特异性PCR(MSP)检测4个候选基因(DAPK、MGMT、P53、RASSF1A)在亲本及耐药株中的甲基化状态.结果 Real-Time PCR可见MCF-7/TAM细胞中抑癌基因DAPK、RASSF1A水平低于亲本株(P＜0.05);而MGMT、P53、DNMT1、DNM3B的mRNA表达水平却较亲本细胞株升高(P＜0.05);基因DNMT3A的mRNA表达水平较低,在亲本及耐药株中均未检出.MSP显示,在MCF-7细胞中,DAPK、P53呈非甲基化状态,而对他莫昔芬细胞株这2个基因为甲基化状态.结合Real-Time PCR检测结果,基因甲基化状态与甲基转移酶(DNMT1、DNMT3B)表达呈正相关性;除P53基因外,基因mRNA表达水平与甲基化状态呈负相关性.结论 相关基因表达差异及启动子的甲基化状态可能与乳腺癌细胞株对他莫昔芬敏感性相关,为下一步进行临床评估和机制探讨提供了依据.     

腺苷干预人结直肠癌SW480细胞RECK基因甲基化及其机制

目的 探讨腺苷干预人结直肠癌SW480细胞RECK基因甲基化及其机制.方法 分别用0、3.0 mmol/L的腺苷干预SW480细胞72 h后,亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测RECK基因启动子区CpG岛甲基化情况;逆转录PCR、Western blot、流式细胞仪检测腺苷处理前后RECK基因mRNA和蛋白的表达、甲基转移酶(methyltransferases DNMT1,DNMT3a)蛋白表达及细胞凋亡的变化.结果 腺苷干预后RECK基因甲基化程度明显低于对照组[(49.14±2.38)％vs (74.84±2.38)％,P＜0.01];腺苷干预后RECK基因mRNA转录及蛋白表达、细胞凋亡均明显高于对照组[0.335 3±0.350 2vs0.080 0±0.003 6,0.603 0 ±0.017 8 vs 0.090 0 ±0.003 0;(27.90±2.32)％vs (5.09±0.30)％,P＜0.01];甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a)蛋白表达均明显低于对照组(0.141 3±0.002 1vs0.645 0±0.009 2,0.130 0±0.004 6vs 0.526 7±0.009 5,P＜0.01).结论 腺苷通过抑制甲基转移酶的活性,降低RECK基因DNA启动子区域的甲基化水平,使RECK基因mRNA及蛋白表达水平增加,促使SW480细胞凋亡.     

探究动脉粥样硬化疾病进程中三个关键DNA甲基转移酶的表达变化

目的:通过构建体内外动脉粥样硬化(AS)模型探究动脉粥样硬化疾病进程中三个关键DNA甲基转移酶的表达变化。方法:14只6周龄的Apo E基因敲除(ApoE~(-/-))的C57BL/6J雄性小鼠,14只6周龄的野生型C57BL/6J雄性小鼠分别随机分两组进行高脂喂养或正常饮食喂养,构建AS体内模型观察主动脉组织病理形态学改变,全自动生物分析仪测定血脂水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测小鼠肝脏组织DNA甲基转移酶(DNMT1,DNMT3A,DNMT3B)的表达变化;利用THP-1构建泡沫细胞模型,qPCR检测DNMTs表达变化。结果:ApoE~(-/-)高脂饮食和ApoE~(-/-)正常饮食小鼠主动脉弓和无名动脉均出现粥样硬化斑块;ApoE~(-/-)高脂饮食和正常饮食小鼠外周血总胆固醇TC显著高于野生型小鼠对应饮食组(P<0.01),同一组内(ApoE~(-/-)小鼠组或野生型小鼠组)高脂饮食小鼠TC显著高于正常饮食小鼠;同普通饮食野生型小鼠组相比,野生型小鼠高脂饮食组和ApoE~(-/-)高脂饮食组DNMT3A表达水平降低(P=0.025,P=0.018),DNMT3B表达水平降低(P=0.006,P=0.013);THP-1细胞泡沫化过程中,DNMT1表达水平显著降低(P=0.022)。结论:肝脏组织及单核细胞DNA甲基转移酶DNMTs的表达改变,可能在动脉粥样硬化疾病发生中发挥重要作用。     

siRNA沉默膀胱癌T24细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的研究

目的 研究siRNA对膀胱癌细胞T24 DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的沉默作用.方法 将筛选出的siRNA转染入膀胱癌T24细胞分为空白组、脂质体组、阴性对照组和siRNA组,分别运用RT-PCR、Western blot检测转染后不同时段DNMT1 mRNA水平、蛋白水平变化.结果 筛选出的siRNA转染膀胱癌T24细胞DNMT1 24 h开始出现mRNA减少,24 h、48 h、72 h分别降至(66.05±4.87)％、(39.36±4.53)％和(40.86±4.81)％(P＜0.05).转染后24 h、48 h、72 h蛋白水平分别降至(90.21±3.68)％、(71.45±3.44)％和(67.74±3.38)％(P＜0.05).结论 siRNA能有效地沉默膀胱癌细胞T24 DNMT1的表达.     

肝/肾/骨型碱性磷酸酶基因ALPL抑制卵巢癌细胞系SKOV3增殖的研究

目的 研究肝/肾/骨型碱性磷酸酶基因(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)在卵巢癌细胞株中的表达及其对卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响.方法 通过qRT-PCR检测ALPL在不同卵巢癌细胞株(HEY、SKOV3、8910、ES-2、OVCAR3、3AO、A2780)mRNA中的表达,并与正常卵巢组织进行比较.在低表达ALPL的卵巢癌细胞株SKOV3中外源性过表达ALPL,通过MTT法、平板克隆实验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期.通过建立裸鼠皮下种植瘤模型,观察过表达ALPL的SKOV3细胞在体内的成瘤能力.结果 ALPL在卵巢癌细胞中的mRNA表达低于正常卵巢组织(P＜0.01),外源性过表达ALPL可抑制SKOV3细胞的增殖和克隆形成率(P＜0.01),阻滞细胞G1期向S的转化,并抑制肿瘤细胞的成瘤能力(P＜0.05).结论 ALPL表达的恢复可以明显抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖及成瘤能力.     

宫颈鳞癌RUNX3基因启动子区甲基化及其临床意义

目的 研究宫颈鳞状细胞癌(鳞癌)组织中RUNX3基因启动子甲基化状态及临床意义.方法 采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)测定50例宫颈鳞癌(CSCC组)、50例宫颈上皮内瘤变(CIN组)手术标本及10例正常宫颈组织(对照组)中RUNX3基因的甲基化状态,分析RUNX3基因甲基化与宫颈鳞癌临床病理学特征的关系.结果 CSCC组和CIN组中分别有27例(54％)和17例(34％)存在RUNX3基因启动子甲基化,而对照组未检出;三组间RUNX3基因启动子甲基化的发生率比较差异有统计学意义(x2=11.500,P＜0.005),CIN不同级别组(CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级)的RUNX3基因启动子甲基化发生率比较差异有统计学意义(x2=9.655,P＜0.05).RUNX3基因启动子甲基化与宫颈鳞癌的分化程度及是否发生淋巴结转移有关(r=-0.367,P=0.017;r =0.288,P=0.042).结论 RUNX3作为抑癌基因参与宫颈鳞癌的发生和发展,可作为对宫颈鳞癌患者进行预后评估的生物学指标.     

linc00152通过调控DNMT3A和DNMT3B促进人宫颈癌细胞生长与侵袭

探讨linc00152在宫颈癌中的生物学功能及其调控机制。运用qRT-PCR检测人宫颈癌细胞与正常宫颈上皮细胞中linc00152的表达;转染sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B于HeLa细胞以敲低细胞中linc00152、DNMT3A和DNMT3B的表达水平,采用qRT-PCR与Western blot法检测转染效率;采用Western blot法检测sh-linc00152对甲基化转移酶(DNMT)3A和3B蛋白表达水平的影响;采用MTT、Transwell侵袭实验检测sh-linc00152、si-DNMT3A以及si-DNMT3B对人宫颈癌HeLa细胞增殖与侵袭的影响。结果显示,linc00152在宫颈癌细胞中的表达水平明显高于正常宫颈上皮细胞(P<0.01);在HeLa细胞中,sh-linc00152组DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平明显低于sh-control组;sh-linc00152组、si-DNMT3A以及si-DNMT3B组HeLa细胞的存活率及穿过基质胶的HeLa细胞数量均明显低于各自对照组。linc00152可能通过调控DNMT3A和DNMT3B信号通路促进人宫颈癌细胞生长与侵袭。