富血小板血浆对大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨影响的实验研究

目的:探讨富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bonemarrowmesenchymal stem cells,rBMSC)体外成骨能力的影响。方法:体外分离、培养rBMSC,经细胞表面标记物检测和体外诱导分化鉴定后,分别采用MTT法检测PRP对细胞增殖活性的影响;细胞化学法检测PRP对成骨诱导后rBMSC碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)活性的影响;RealTime-PCR检测PRP对细胞成骨分化指标Col-3、OPN mRNA表达水平的影响;扫描电镜观察PRP对rBMSC在Bio-Oss上粘附的影响。结果:rBMSC传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;细胞表面标记物CD29阳性率为88.2%,CD90阳性率为98%,CD34细胞阴性率为2.8%,CD45细胞计数阴性率为2.7%;成骨诱导21 d后,茜素红染色可见明显矿化结节;成脂诱导14 d后,油红O染色可见红色脂滴形成。MTT检测,10%PRP组在培养1、3、5、7、9 d各时间点的OD值均显著高于空白对照组(P<0.05)。ALP染色显示,无论是诱导培养7 d还是14 d,成骨诱导液+PRP组的ALP活性均明显高于单纯成骨诱导液组,差异有统计学意义(P<0.05);另外,各组不同诱导培养时间点相比还发现,无论是实验组还是对照组,在诱导7 d时,ALP活性均较低;而在14 d,ALP的活性明显升高。RealTime-PCR检测显示,单纯10%PRP诱导培养7 d和14 d后细胞Col-3、OPN mRNA水平虽稍低于成骨诱导液组,但明显高于空白对照组,而10%PRP联合成骨诱导液诱导培养7 d和14 d的Col-3、OPN mRNA的表达量更高,与其他各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。另外各组诱导培养14 d的Col-3、OPN mRNA水平显著高于相应的7 d组(P<0.05)。扫描电镜结果显示PRP明显促进rBMSC在Bio-Oss骨粉上的粘附与伸展。结论:PRP对rBMSC的增殖、成骨分化,以及在生物材料上的粘附能力均具有明显的促进作用。     

牙乳头/牙囊细胞交互作用对细胞多能性的作用

目的:研究细胞交互作用对细胞多能性的调控作用。方法:建立牙乳头(DPCs)和牙囊细胞(DFCs)体外共培养模型,二者单独培养的细胞为对照组。采用细胞计数、β-gal染色检测细胞生长和衰老情况;免疫荧光染色检测共培养条件下多能性相关因子Oct-4、Sox2和c-Myc的表达变化;通过ALP活性测试检测矿化诱导后的DPCs和DFCs的矿化能力。结果:共培养组的DPCs和DFCs的细胞数明显高于对照组(P<0.05);培养至第7代时,共培养组的DPCs、DFCs中与衰老相关的SA-b-gal表达较对照组明显减弱(P<0.05);Oct-4、Sox2和c-Myc在共培养组DPCs和DFCs中的表达明显强于对照组;共培养组的DPCs和DFCs经矿化诱导14、21 d后,其ALP活性均显著高于对照组(P<0.05)。结论:DPCs和DFCs可通过体外交互作用抑制细胞衰老、促进细胞的多能性相关因子的表达、提高细胞的矿化能力。     

人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

目的:探索人牙髓细胞条件培养液(HDPSCs-CM)对人牙囊细胞(HDFSCs)向成骨分化的作用.方法:利用胶原酶消化法获得HDFSCs,经纯化鉴定后培养于HDPSCs-CM中;CCK-8检测HDFSCs增殖活性,观察细胞形态改变;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色定性分析细胞成骨能力的改变.qRT-PCR检测HDFSCs中骨膜蛋白(POSTN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)以及骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达情况.结果:经HDPSCs-CM诱导后,HDFSCs形态发生成牙骨质或成骨样改变;诱导组HDFSCs增殖活性受到明显抑制(P<0.05或P<0.01);诱导组ALP染色强于对照组,茜素红S染色矿化结节多于对照组;诱导组POSTN、Col-Ⅰ、ALP、BSP、OPN的表达量明显增高(P<0.05或P<0.01).结论:HDPSCs-CM能促进HDFSCs成骨分化.     

猪牙乳头细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:培养新生猪的牙乳头细胞,探讨其传代细胞的生物学特性。方法:选择刚出生1￣3d的新生猪,取出磨牙胚,分离牙乳头,用酶消化法培养猪牙乳头细胞,并用波形丝蛋白和细胞角蛋白鉴定细胞来源。观察细胞的生长规律,通过免疫组化染色检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、牙本质涎蛋白(DSP)等的表达情况。结果:猪牙乳头细胞在体外培养时生长良好,波形丝蛋白染色阳性而细胞角蛋白染色阴性,细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、DSP呈阳性表达。结论:通过酶消化法,可以体外扩增培养猪牙乳头细胞,细胞为间充质来源,其传代细胞在合成胶原及DSP的能力上与体内牙乳头细胞相似,提示猪牙乳头细胞可能具备作为牙髓-牙本质复合体再生研究种子细胞的潜能。     

人牙槽成骨细胞的体外培养和生物学特性检测

目的:研究人牙槽成骨细胞体外培养及其生物学特性.方法:取人牙槽骨用组织块法进行体外细胞培养,用倒置显微镜观察细胞生长、细胞形态,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖;在条件培养液中培养后用酶动力学方法作碱性磷酸酶(ALP)活性定量测定、Alizarin red 染色和von Kossa染色作成骨特性检测,同位素 3H掺入结合细菌胶原酶消化法测定I型胶原的合成.结果:培养第5 天细胞从组织块中爬出,再培养14～16 d可以传代;在条件培养液中细胞ALP活性明显,Alizarin red 染色和von Kossa染色细胞呈阳性,体外培养人牙槽成骨细胞具有分泌I型胶原的功能. 结论:体外培养的人牙槽成骨细胞生长良好,并具有成骨细胞的形态和生物学特性.     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化能力影响的研究

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs-HSA)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)骨向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪检测牙周膜细胞表型分子CD44、CD146、stor-1、CD90,对其进行干细胞鉴定,将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGE-HSA共同培养,并矿化诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况、碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real timePCR)检测成骨基因表达情况。结果:流式细胞仪细胞表型分析CD44、CD146、stor-1、CD90表达呈阳性。成骨诱导21 d后茜素红染色,对照组和实验组均出现不同程度的矿化结节,定量分析显示1、10、100、200μg/mLAGEs组矿化能力均比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间矿化能力均有统计学差异(P<0.05),且随着AGEs浓度的升高,矿化能力逐渐降低。成骨诱导7 d ALP染色比较发现各实验组均比对照组减弱。成骨诱导1周后RT-PCR检测各实验组的成骨基因ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2 mRNA表达水平均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间各成骨基因的表达也有统计学差异(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的骨向分化,并在一定范围内呈浓度依赖性。     

Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨骨髓基质干细胞体外培养及其成骨特性观察

目的:观察Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨分化特性。方法:无菌条件下从10周龄GK大鼠(实验组)及同龄正常Wistar大鼠(对照组)下颌骨获取BMSCs,采用全骨髓贴壁培养法对细胞进行纯化及培养,流式细胞仪检测干细胞表型.取第3代细胞成骨诱导培养,分别对两组细胞行茜素红染色,碱性磷酸酶染色及活性测定,培养基钙、磷含量测定,以及real-time PCR测定Runx2基因表达变化。结果:成功培养出Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs,与正常组比较,实验组BMSCs茜素红染色变浅、钙结节形成减少,碱性磷酸酶(ALP)活性下降,细胞钙、磷分泌显著降低,差异有统计学意(P<0.05);Runx2 mRNA表达也明显降低(P<0.05)。结论:Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs的成骨分化能力受到损害,并且即使在正常糖浓度下培养其成骨能力仍无法恢复。     

牙本质非胶原蛋白诱导颅神经嵴干细胞向成牙本质细胞表型分化

目的探讨颅神经嵴干细胞(CNCSC)用于牙再生研究的可行性,观察牙本质基质非胶原蛋白(DMNCP)对CNCSC的成牙本质样细胞表型分化的影响。方法小鼠神经管组织块无血清条件培养法获取颅神经嵴干细胞,以DMNCP体外诱导CNCSC的分化,形态学、免疫细胞化学、茜素红特染等方法,分别从Ⅰ型胶原表达、牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙结节形成情况,鉴定CNCSC的成牙本质样细胞表型。结果诱导后的CNCSC呈现I型胶原、DSPP阳性表达,ALP活性增高,钙结节形成,具有成牙本质细胞表型特征。结论DMNCP具有诱导CNCSC向成牙本质细胞表型分化的作用,利用CNCSC开展牙再生研究是可行的。     

骨骼肌卫星细胞体外培养及分化为成骨样细胞的实验研究

目的:评估骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecells,SMSCs)体外分化为成骨样细胞的能力,探讨骨骼肌卫星细胞作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法:取新生Wistar大鼠骨骼肌,采用酶消化法分离出SMSCs,体外原代及传代培养,经腺病毒介导的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)基因转染后,行成骨细胞标志物活性的检测及细胞化学染色,并进行细胞体外矿化能力的测定。结果:转染后细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性增强(P<0.01)且组织化学染色呈阳性,骨钙素及I型胶原的免疫细胞化学染色呈阳性,21d后见钙结节形成。结论:体外培养的骨骼肌卫星细胞可以向成骨方向转化,有望成为骨组织工程的种子细胞。     

辛伐他汀对大鼠成骨细胞增殖和分化功能的实验研究

目的 :研究辛伐他汀对大鼠成骨细胞增殖和分化功能的影响 ,探讨其刺激成骨的作用机制。方法 :体外培养4周龄大鼠骨髓基质细胞 ,在条件培养液诱导下 ,分化为成骨细胞。以不同浓度辛伐他汀 (0.062μmol/l ,0.125μmol/l,0.25μmol/l ,0.5μmol/l,1.0μmol/l)作用于成骨细胞 ,用MTT法测定细胞增殖情况 ;PNPP法测定细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性 ;检测培养液中羟脯氨酸 (Hpro)含量反映细胞I型胶原的分泌情况 ;通过矿化结节计数反映细胞的矿化能力。结果 :辛伐他汀抑制细胞增殖 ,在10 -7mol/l浓度组与对照组比较有统计学意义 (P<0.05) ;各浓度组的ALP活性均增加 ,以0.5μmol/l对酶活性的影响最显著 (P<0.05) ;羟脯氨酸含量增加 ,以10-7mol/l浓度组与对照组比较有统计学意义 (P<0.05) ;辛伐他汀显著提高细胞的矿化能力 ,0.5μmol/l浓度作用最显著 ( +43.2 %,P<0.05)。结论 :辛伐他汀抑制细胞增殖 ,促进细胞ALP活性增加 ,I型胶原分泌增强 ,提高成骨细胞的矿化能力     

大鼠牙乳头细胞体外培养和矿化的实验研究

目的　观察体外培养的大鼠第一磨牙牙乳头细胞的生物学特征。方法　大鼠第一磨牙牙乳头细胞培养 ,免疫组织化学染色、钙盐染色。结果　培养的大鼠牙乳头细胞表达Ⅲ型胶原、纤维黏连蛋白、碱性磷酸酶 ,当细胞培养于含 5mmol/Lβ-磷酸甘油钠和 5 0 μg/mlL -维生素C的培养液中时 ,细胞可形成矿化的胞外基质。结论　培养的大鼠牙乳头细胞保留体内的某些特征 ,并可用于研究牙髓组织的钙化调节。     

富血小板血浆对鼠骨骼肌卫星细胞增殖及成骨活性的影响

目的:观察富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对体外培养的SD大鼠骨骼肌卫星细胞(muscle satellitecells,MSCs)增殖与诱导成骨的影响,探讨富血小板血浆诱导MSCs成骨的可能机制。方法:从SD大鼠心脏抽取全血,参照Landesberg法制备PRP,并进行全血和PRP中血小板(PLT)计数。取新生3～5 d的SD大鼠四肢骨骼肌,采用酶消化及差速贴壁法体外培养鼠MSCs,采用免疫组织化学的方法进行鉴定。四甲基偶氮唑盐法(MTT)观察不同浓度的自体PRP(1.6%、6.25%、12.5%)对MSCs增殖的影响;以碱性磷酸酶(ALP)钙钻法染色、ALP活性测定、茜素红染色及骨钙素和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色法,检测PRP对MSCs向成骨细胞分化的诱导作用。结果:采用Landesberg法成功获取PRP;酶消化及差速贴壁的方法成功获取MSCs,desmin及α-sarcomeric actin免疫组织化学染色阳性;浓度为6.25%的PRP可明显促进MSCs的增殖;ALP钙钴法染色阳性,胞质内见大量黑色颗粒沉积;ALP活性较对照组增高明显(P<0.01);茜素红染色可见钙结节形成;骨钙素和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论:PRP对体外培养的鼠MSCs增殖及成骨分化活性具有显著的促进作用。     

2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞骨向分化研究

目的:比较牙周炎和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞成骨分化能力。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周炎患者牙周膜干细胞(P-PDLSCs组)和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞(D-PDLSCs组),计算克隆形成率,免疫荧光检测细胞表型分子CD146、STRO-1进行干细胞鉴定,矿化诱导后茜素红染色观察矿化结节形成,实时定量聚合酶链反应(real time PCR)检测成骨相关基因表达。结果:P-PDLSCs组和D-PDLSCs组细胞的克隆形成率分别为(25.6±2.7)%和(17.9±1.7)%(P﹤0.05);P-PDLSCs组CD146和STRO-1表达明显高于D-PDLSCs组;成骨诱导21 d后茜素红染色,2组均出现不同程度的矿化结节,P-PDLSCs组的矿化能力较D-PDLSCs组强;成骨诱导1周后D-PDLSCs组碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runx-2和Ⅰ型胶原蛋白(type-Ⅰcollagen,Col-Ⅰ)的mRNA表达均明显低于P-PDLSCs组(P<0.05)。结论:糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞成骨分化能力低于单纯牙周炎患者牙周膜干细胞。     

浓缩生长因子提取液对 MC3T3-E1细胞影响的实验研究

目的:探讨浓缩生长因子提取液(CGFe)对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响。方法:实验组和对照组分别使用含有及不含有CGFe的α-MEM培养液培养MC3T3-E1细胞。培养1、3、5 d后MTT法测定细胞增殖,ALP试剂盒检测碱性磷酸酶活性;培养7、14 d后茜素红染色观察钙结节形成;荧光实时定量PCR测定RUNX2和OSX mRNA的表达。结果:随着培养时间延长,实验组的细胞增殖、碱性磷酸酶活性、钙结节数目及基因表达量均高于对照组(P<0.05)。结论:浓缩生长因子提取液能有效地促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化。     

人脂肪干细胞体外向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的:探讨人脂肪干细胞(hASCs)的分离方法、体外增殖能力及定向诱导分化为成骨细胞的潜能.方法:从脂肪抽吸物中分离、培养具有多向分化潜能的脂肪干细胞,比较原代(P0)及传代第1、2、5代(P1、P2、P5)细胞的生长曲线.实验组取P2细胞.应用成骨诱导液向成骨细胞定向诱导分化,并以未诱导组为对照组,利用ALP染色,von Kossa染色、免疫荧光检测、RT-PCR等方法对细胞成骨潜能进行评价.结果:传代细胞较原代细胞增殖速度快.P1、P2、P5均具有一些共同特征,传代培养的潜伏期约为24 h,传代培养细胞的对数增殖期约为2～3 d,接种后第4～5天进入平台期;细胞诱导14d后,实验组ALP染色呈阳性反应,对照组阴性;von Kossa染色.实验组出现深棕色结节状沉积,且随诱导时间增加而加深,对照组无结节状沉积出现;免疫荧光检测,实验组和对照组均表达Ⅰ型胶原,实验组骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)检测为阳性,对照组为阴性或弱阳性;RT-PCR检测表明,实验组诱导14d时有ALP、Osteopontin表达,对照组阴性;实验组、对照组及成骨细胞均有Ⅰ型胶原阳性表达.结论:hASCs在体外培养条件下生长良好,P2细胞在诱导培养下可向成骨细胞分化,为以hASCs为种子细胞构建组织工程骨奠定了基础.     

aFGF和TGFβ1联合诱导猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化

目的建立猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化的体外诱导方案。方法联合应用aFGF和TGFβ1对体外培养的猪牙乳头细胞进行平面诱导,观察诱导后细胞的形态学变化,通过Von Kossa染色检测诱导后细胞的矿化能力,并采用免疫荧光染色和RT-PCR检测成牙本质细胞特异性标志物——DSP蛋白和DSPP mRNA在诱导后细胞中的表达。结果诱导后部分细胞出现细长的单侧细胞突起,在矿化液培养2周后形成典型的矿化结节,并且表达DSP蛋白和DSPP mRNA。结论联合应用aFGF和TGFβ1可以诱导体外培养的猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化。     

人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导

目的：体外培养、鉴定人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）并定向诱导分化为成骨细胞，探讨人PDLSCs的多向分化潜能：方法：体外分离、培养人牙周膜细胞，待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养，筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC），矿化诱导培养21d后检测钙结节形成情况、ALP活性，免疫细胞化学检测骨涎蛋白（BSP）、Ⅰ型胶原表达，RT—PCR检测ALP、BSP mRNA表达。结果：人PDLSCs体外诱导培养21d后可见钙结节形成，成骨细胞相关蛋白及mRNA均阳性表达。结论：人PDLSCs在体外诱导条件下具有成骨潜能。     

低强度脉冲超声对不同钛表面骨髓间充干细胞成骨分化的影响

目的:观察低强度脉冲超声(LIPUS)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在钛片表面成骨分化的影响.方法:将体外培养的BMSCs分别接种于光滑钛表面和大颗粒喷砂酸蚀(SLA)钛表面,进行矿化诱导并实施超声干预和假刺激.于矿化诱导后3、7d进行碱性磷酸酶(ALP)定量检测,14 d进行ALP染色观察;矿化诱导21 d后行茜素红染色;于矿化诱导14、21 d检测成骨相关基因及蛋白表达.结果:矿化诱导后3、7d超声组ALP活性较对照组高(P＜0.05),14 d超声组与对照组相比钛片表面ALP染色明显深染;茜素红染色显示,21 d后超声组的染色更明显且形成更多的矿化结节;超声组的成骨相关蛋白成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白表达增高;RT-PCR检测到成骨相关基因、ALP、成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白均有不同程度表达增高(P＜0.05).结论:LIPUS可以促进光滑及SLA钛表面BMSCs的成骨分化.     

机械牵张对人成骨细胞ALP活性及I型胶原表达的影响

目的　观察机械张力对成骨细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性和I型胶原基因表达的影响。方法　通过Flexercell细胞体外拉伸力学装置对人成骨细胞MG 6 3进行牵张加载实验 ,用生化方法和RT PCR反应检测细胞受张力刺激 6、12、2 4和 4 8h后的ALP活性和I型胶原mRNA的表达变化。结果　机械张力能明显增强MG 6 3细胞的ALP活性。I型胶原mRNA的表达在张力作用后 6～ 12h减弱 ,2 4h后表达升高 ,4 8h最高。结论　机械张力不仅能促进成骨细胞ALP的分泌活性 ,而且还能对成骨细胞胶原合成产生影响。     

稀土元素铈对骨髓间充质干细胞成骨分化调控的体外实验研究

目的:研究铈离子对体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力的影响。方法:分离培养小型猪骨髓间充质干细胞,分别用含有1×10-5mol/L CeCl3的成骨诱导液和单纯成骨诱导液进行培养;然后用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测两组细胞诱导培养1、7、14、21 d的ALP活性;用实时荧光定量PCR分析两组细胞诱导培养14 d时的成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA的表达水平。结果:诱导培养1、7、14、21 d后,CeCl3组各时间点的ALP活性均较对照组显著增加(P<0.05);诱导14 d后,CeCl3组的各成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论:CeCl3能促进BMSCs的成骨分化。