缺氧及HIF-1α对结直肠癌上皮-间质转化及侵袭增殖的影响

目的 研究不同缺氧条件下缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、锌指转录因子Snail及上皮钙黏蛋白(E-cadherin)在结直肠癌SW480细胞中的表达水平,以及它们对细胞的增殖凋亡和侵袭迁移力的影响,探讨三者在结直肠癌的缺氧及上皮间质转化中的作用及可能机制.方法 利用氯化钴(CoCl2)化学诱导细胞缺氧模型,实验分组:常氧组、低氧组和无氧组.采用MTT法检测结直肠癌SW480细胞的生长增殖活性,体外侵袭实验(Transwell小室法)检测细胞的侵袭迁移力,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡及周期变化,RT-PCR及Western blot检测细胞中HIF-1α、Snail及E-cadherin mRNA与蛋白的表达.结果 MTT结果显示随CoCl2浓度的增加结直肠癌SW480细胞的增殖活性逐渐增加(P＜0.05);Transwell结果显示随缺氧程度的增加穿过基质膜和聚碳酸酯膜的细胞数逐渐增多,侵袭迁移率增加(P＜0.05);FCM检测结果显示与常氧组比较,无氧组和低氧组G0/G1期SW480细胞明显减少,G2/S期细胞明显增多,细胞凋亡率降低(P＜0.05);RT-PCR与Western blot检测结果显示低氧组、无氧组与常氧组比较,SW480细胞内HIF-1α和Snail mRNA与蛋白的表达增加,E-cadherin mRNA和蛋白的表达降低(P＜0.05),且HIF 1 α和Snail的表达呈显著正相关.HIF-1α、Snail与E-cadherin的表达均呈显著负相关(P＜0.05).结论 缺氧及HIF-1α可促进结直肠癌SW480细胞株的体外生长增殖活性,抑制其凋亡,增强其体外侵袭迁移能力,其机制可能是缺氧诱导HIF-1α表达上调直接作用于SW480细胞产生,亦可能是缺氧或HIF-1α表达上调通过促进Snail表达,抑制E-cadherin表达,间接导致EMT的发生发展而产生.     

基因沉默HIF-1α在结直肠癌SW480细胞的缺氧与上皮-间质转化中的作用

目的通过基因沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α),研究其对结直肠癌SW480细胞的生长增殖、侵袭迁移能力,及对锌指转录因子(Snail)与上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达的影响和作用。方法利用氯化钴(CoCl2)化学诱导建立结直肠癌SW480细胞的缺氧模型,设计合成HIF-1α的小干扰RNA(HIF-1α-siRNA)并将其转染入细胞内。通过四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测细胞的体外生长增殖活性,体外侵袭实验(Transwell法)检测细胞的体外侵袭迁移力,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫蛋白印迹(Western blot)检测细胞中HIF-1α、Snail及E-cadherinmRNA与蛋白的表达情况。结果 MTT法检测结果显示,缺氧条件下,基因干扰组的OD值及细胞存活率均降低(P<0.05);体外侵袭实验结果显示,基因干扰组侵袭迁移率降低(P<0.05);RT-PCR与Western blot检测结果显示,基因干扰组中HIF-1α和Snail mRNA和蛋白的表达明显降低,E-cadherin mRNA和蛋白的表达明显增强(P<0.05),对3种因子进行相关性分析,结果显示HIF-1α和Snail的表达呈正相关,HIF-1α和Snail均与E-cadherin的表达呈负相关(P<0.05)。结论 RNA干扰沉默HIF-1α基因可抑制结直肠癌SW480细胞的体外生长增殖和体外侵袭迁移能力,其机制可能是由于基因沉默HIF-1α导致细胞中Snail低表达,E-cadherin高表达,抑制了EMT发生、发展所致。     

Akt抑制剂MK-2206在缺氧环境下对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭的影响

目的:探讨Akt抑制剂MK-2206在缺氧环境下对人结肠癌SW480细胞增殖、侵袭的影响。方法:根据CCK-8实验结果选择CoCl2和MK-2206的浓度,最后分成空白组、MK-2206组、CoCl2组、MK-2206+CoCl2组;Transwell小室实验检测四组细胞的迁移和侵袭能力;RT-PCR法检测各细胞组中Akt、mTOR、HIF-1α的mRNA表达水平;Western blot技术检测各细胞组中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、HIF-1α蛋白表达的差异性情况。结果:CoCl2诱导的缺氧环境可以促进SW480细胞的侵袭、迁移(P＜0.05),同时能够促进HIF-1α的mRNA和蛋白表达(P＜0.05),但是低浓度范围内的CoCl2对SW480细胞增殖活性无明显影响(P＞0.05);MK-2206可以在体外的常氧和缺氧环境中抑制SW480细胞的增殖活性和侵袭、迁移能力(P＜0.05);MK-2206能在体外的常氧环境下抑制SW480细胞的Akt、mTOR、HIF-1α的mRNA表达(P＜0.05),缺氧环境无明显作用;同时MK-2206能够在常氧和缺氧环境中显著降低p-Akt、p-mTOR、HIF-1α的蛋白表达水平(P＜0.05)。 结论:Akt抑制剂MK-2206可以在体外的常氧和缺氧环境下抑制SW480细胞的增殖活性和侵袭能力,但缺氧环境可能会弱化MK-2206对SW480细胞迁移的抑制作用。     

HIF-1α对胶质瘤U251细胞增殖及侵袭的影响

目的 探讨氯化钴(CoCl2)模拟化学缺氧复氧中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白的表达及其对人胶质瘤U251细胞增殖及侵袭的影响.方法 在培养基中加入和去除CoCl2模拟化学缺氧和缺氧复氧,采用免疫印迹法(Western blot)检测CoCl2与HIF-1α蛋白表达关系;通过MTT、过河实验、黏附试验分别检测细胞侵袭、迁移运动能力和黏附能力.结果 人胶质瘤U251细胞中存在HIF-1α蛋白表达;在CoCl2模拟缺氧的时-效关系实验中,100μmol/L CoCl2刺激细胞6h、12h、24h时HIF- 1α蛋白呈递增(分别 为1.024±0.03、2.35±0.04、2.82±0.12)(P<0.05),24h达高峰,48h明显下降(1.82±0.05).同时,在量-效关系实验中,CoCl2 50μmol/L、100μmol/L和150μmol/L刺激细胞24h时HIF-1α蛋白呈递增(分别为1.78±0.03、1.81±0.03、2.12±0.12)(P<0.05);MTT发现CoCl2诱导的缺氧对细胞增殖起抑制作用;过河实验发现缺氧24h复氧24h后细胞的迁移运动能力增加;细胞黏附实验发现缺氧24h复氧24h后细胞的黏附力增加.结论 CoCl2能诱导人胶质瘤U251细胞HIF-1α蛋白过度表达,而且存在一定的时-效关系;经CoCl2诱导的缺氧后复氧,肿瘤细胞增殖能力下降,细胞的迁移运动能力和黏附能力增加.     

缺氧诱导因子1 -α参与结直肠癌细胞上皮间质转化及DNA同源重组修复的机制

目的:研究氯化钴(CoCl2)模拟的细胞体外缺氧微环境对结直肠癌细胞株SW480及Caco-2上皮间质转化及DNA同源重组修复的影响并探究其机制.方法:应用不同浓度的氯化钴(CoCl2)处理SW480及Caco2细胞72 h后,CCK8法检测细胞增殖能力,划痕及Transwell试验检测细胞的迁移及侵袭能力,流式细胞术(FCM)检测细胞周期及凋亡情况,RT-PCR及Western blotting实验检测细胞内相关基因mRNA及蛋白水平的变化情况.结果:CCK-8实验提示细胞在缺氧后增殖能力明显增加(P＜0.05);划痕试验及Transwell侵袭实验提示细胞在缺氧条件下迁移及侵袭能力明显增强(P＜0.05);流式细胞术提示细胞在缺氧后被阻滞在S期(P＜0.05),凋亡率明显下降(P＜0.05);RT-PCR试验表明缺氧后细胞内缺氧诱导因子1-α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)及RAD51的mRNA水平上调(P＜0.05);Western blotting实验表明在缺氧环境下细胞内HIF-1α表达上调(P＜0.05),上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition)相关蛋白:钙黏附蛋白E(E-cadherin)表达下调,波形蛋白(vimentin)及转录抑制因子(snail)表达上调(P＜0.05),DNA同源重组相关蛋白BRCA1及RAD51表达上调(P＜0.05),PI3K/AKT(磷脂酰肌醇-3-羟激酶)信号通路下游关键信号分子AKT1及共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant gene)的编码产物ATM激酶磷酸化水平显著上调(P＜0.05).结论:慢性缺氧环境可促进结直肠癌细胞SW480及Caco-2的增殖、迁移和侵袭能力,抑制凋亡,其机制可能与HIF-1 α/PI3 K-AKT、HIF1-α/ATM信号通路介导EMT及DNA同源重组修复过程有关.     

过表达缺氧诱导因子-1α的结直肠癌裸鼠可视化模型的建立

目的:建立一种荧光可视化显像且稳定过表达缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的裸鼠结直肠癌移植瘤模型。方法:对不同的人结直癌细胞系(SW480、SW620、LOVO及HCT116细胞)用缺氧诱导剂Co Cl2处理,根据HIF-1α被诱导表达的情况选择合适的靶细胞;将HIF-1α的c DNA序列克隆至慢病毒表达质粒p LV-TRC-EGFP,构建p LVHIF1α-EGFP慢病毒表达质粒,并包装过表达HIF-1α的慢病毒颗粒Lenti-HIF1α-EGFP。将Lenti-HIF1α-EGFP感染SW480细胞,嘌呤霉素筛选稳定过表达HIF-1α的细胞株SW480HIF-1α,Western blotting检测SW480HIF-1α细胞内HIF-1α及其下游蛋白VEGF、M1型丙酮酸激酶(pyruvate kinase expression M1,PKM1)的表达情况,Transwell实验检测其迁移能力。裸鼠腹腔注射SW480HIF-1α建立结直肠癌移植瘤模型,倒置荧光显微镜观察裸鼠腹腔移植瘤结节。结果:常氧条件下4种结直肠癌细胞均不表达HIF-1α,经Co Cl2诱导后,除SW480细胞系以外的细胞均可被诱导表达HIF-1α,故选择SW480细胞作为研究靶细胞。成功构建稳定过表达HIF-1α的细胞株SW480HIF-1α,SW480HIF-1α细胞内HIF-1α、VEGF和PKM1的表达水平均高于野生型SW480细胞,其迁移能力较野生型SW480细胞显著增强[观察视野内迁移细胞数:(250±11)vs(50±5)个,P<0.01]。SW480HIF-1α组裸鼠肠壁形成肿瘤结节数量显著多于SW480组[(15±4)vs(4±1)个,P<0.05]。结论:成功建立了高表达HIF-1α的荧光可视化裸鼠移植瘤模型,为进一步的相关功能学研究以及药物筛选提供条件。     

HIF-1α对人卵巢癌细胞生物学行为的影响

背景与目的:HIF-1α是一个在缺氧状态下重要的转录调节因子,控制调节各种由缺氧引起的相关基因表达,参与肿瘤的恶化、浸润和转移,在肿瘤领域已成为研究热点。本文主要研究CoCl2模拟化学缺氧复氧中HIF-1α的表达,及其对人卵巢癌HO-8910PM细胞株生物学行为的影响。方法:在培养基中加入和去除CoCl2模拟化学缺氧和缺氧复氧,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CoCl2与HIF-1α的mRNA转录的量-效和时-效关系;通过MTT、Boyden小室、细胞黏附试验分别检测细胞生长、侵袭力和黏附力。结果:人卵巢癌HO-8910PM细胞株中存在HIF-1α的mRNA转录;在CoCl2模拟缺氧的时-效关系实验中,150μmol/LCoCl2刺激细胞8h、16h、24h时HIF-1αmRNA转录呈递增(分别为2.11±0.03、2.52±0.05、2.78±0.11)(P<0.05),24h达高峰,48h明显下降。同时,在量-效关系实验中,100μmol/L、150μmol/L刺激细胞16h时HIF-1αmRNA转录呈递增(分别为1.54±0.03、2.07±0.13)(P<0.05);MTT发现CoCl2诱导的缺氧对细胞生长起抑制作用;Boyden小室检测细胞侵袭力实验发现缺氧16h复氧24h后细胞的侵袭力增加(穿越细胞膜的细胞数86±9,较对照组53±10增加)(P<0.05);细胞黏附实验发现缺氧16h复氧24h后细胞的黏附力增加(P>0.05)。结论:CoCl2能诱导HO8910-PM细胞HIF-1α的过度转录,而且存在一定的时-效关系;经缺氧后复氧,肿瘤细胞的侵袭力和黏附力增加,且肿瘤细胞的侵袭力增加统计学差异显著。     

HIF-1α对胶质瘤U251细胞增殖及侵袭的影响

目的：探讨氯化钴（CoCl2）模拟化学缺氧复氧中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白的表达及其对人胶质瘤U251细胞增殖及侵袭的影响。方法：在培养基中加入和去除CoCl2模拟化学缺氧和缺氧复氧,采用免疫印迹法（Western blot）检测CoCl2与HIF-1α蛋白表达关系;通过MTT、过河实验、黏附试验分别检测细胞侵袭、迁移运动能力和黏附能力。结果：人胶质瘤U251细胞中存在HIF-1α蛋白表达;在CoCl2模拟缺氧的时-效关系实验中,100μmol/L CoCl2刺激细胞6h、12h、24h时HIF-1α蛋白呈递增（分别为1.024±0.03、2.35±0.04、2.82±0.12）（P〈0.05）,24h达高峰,48h明显下降（1.82±0.05）。同时,在量-效关系实验中,CoCl250μmol/L、100μmol/L和150μmol/L刺激细胞24h时HIF-1α蛋白呈递增（分别为1.78±0.03、1.81±0.03、2.12±0.12）（P〈0.05）;MTT发现CoCl2诱导的缺氧对细胞增殖起抑制作用;过河实验发现缺氧24h复氧24h后细胞的迁移运动能力增加;细胞黏附实验发现缺氧24h复氧24h后细胞的黏附力增加。结论：CoCl2能诱导人胶质瘤U251细胞HIF-1α蛋白过度表达,而且存在一定的时-效关系;经CoCl2诱导的缺氧后复氧,肿瘤细胞增殖能力下降,细胞的迁移运动能力和黏附能力增加。     

HIF-1α基因干扰对大鼠CBRH-7919肝癌细胞HIF-1α与VEGF表达影响的研究

目的:探讨沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对肝癌细胞在缺氧状态下表达HIF-1α及血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法:选用大鼠CBRH-7919肝癌细胞株作为研究对象,利用氯化钴(CoCl2)模拟缺氧状态,构建3组特异性较强的HIF-1α siRNA表达载体,采用小分子RNA干扰技术沉默细胞HIF-1α的基因表达,分别利用real time RT-PCR和蛋白质印迹法检测肝癌细胞HIF-1α和VEGF在mRNA及蛋白水平的表达变化.结果:在不同浓度CoCl2模拟缺氧条件下,随着CoCl2浓度的增高及时间的推移,肝癌细胞HIF-1α和VEGF的表达(mRNA及蛋白水平)较常氧对照组(0 μmol/L CoCl2)显著增多,差异均有统计学意义,P＜0.05.应用3组不同HIF-1α和siRNA表达载体转染缺氧条件下的肝癌细胞后,细胞的HIF-1α和VEGF的基因(mRNA)表达量与未转染HIF-1α siRNA表达载体对照组相比较明显减少,同步检测两者的蛋白表达亦明显减少,与对照组差异均有统计学意义,P＜0.05.结论:缺氧可以诱导肝癌细胞HIF-1α和VEGF的表达,siRNA沉默HIF-1α能显著抑制缺氧状态下诱导的VEGF表达.     

缺氧时缺氧诱导因子-1α在胃癌细胞的表达及其同细胞增殖凋亡的关系

目的研究缺氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α)在缺氧的胃癌细胞SGC-7901的表达及其同缺氧时Fas、PCNA关系,探讨HIF-1α同缺氧时胃癌细胞增殖凋亡的关系。方法产气袋法(GasPaK)制造缺氧细胞培养条件,细胞免疫化学观察SGC-7901细胞HIF-1α、PCNA及Fas的变化。结果缺氧时SGC-7901细胞HIF-1α表达明显上调,HIF-1α表达随缺氧时间延长而增加。缺氧时HIF-1α表达与Fas呈负相关(P<0.05),同PCNA表达无关。结论缺氧能使SGC-7901细胞HIF-1α表达明显上调,HIF-1α抑制缺氧诱导的细胞凋亡,同缺氧时胃癌细胞增殖无关。     

联合反义缺氧诱导因子-1α与B7-1基因治疗肿瘤的实验研究

目的探讨联合应用反义缺氧诱导因子1α(HIF1α)与B71基因治疗肿瘤的疗效。方法构建反义HIF1α和B71表达载体,用阳离子脂质体辅助,联合或单独导入肿瘤,观察肿瘤生长情况。采用免疫组化、蛋白印迹等方法检测基因表达,并进行血管密度评估。结果单独转染反义HIF1α的表达质粒可以阻断肿瘤缺氧诱导反应,下调血管内皮细胞生长因子的表达,抑制新生血管形成和肿瘤生长,肿瘤的血管密度由对照组的19.5±1.8降至12.4±2.3。联合应用反义HIF1α转染和B71可根除大的肿瘤。结论反义HIF1α基因治疗可以提高B71介导的抗肿瘤免疫治疗的疗效。     

Differential regulation of VEGF, HIF1alpha and angiopoietin-1, -2 and -4 by hypoxia and ionizing radiation in human glioblastoma

We examined how ionizing radiation (IR) delivered under either severe hypoxia (< 0.1% O2) or normoxia affects the expression of hypoxia inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) and the angiogenic factors vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietins 1, 2 and 4 in U87 human glioblastoma cells. IR was delivered as single doses of 0, 2, 5, 10 and 20 Gy after 6-hr hypoxic incubation and in normoxic controls. Irradiation at any dose did not affect the cellular protein levels of any of the angiopoietins, whereas hypoxia led to increasing levels of both angiopoietin-4 and angiopoietin-2. Levels of angiopoietin-1 protein were unaltered throughout the observation period. A dose-dependent increase in levels of secreted VEGF in the medium occurred after IR at doses from 5-20 Gy. In hypoxic cells, 20 Gy IR induced an additional significant increase in VEGF relative to nonirradiated hypoxic control cells with elevated baseline VEGF levels induced by hypoxia. HIF-1alpha and glucose transporter-1 (Glut-1) were not correspondingly upregulated by IR. Blocking HIF-1alpha by antisense treatment induced a reduced baseline VEGF at normoxia, while the relative upregulation of VEGF by IR was unaffected. These data provide evidence that VEGF is upregulated by IR by mechanisms independent of HIF-1 transactivation.     

短发夹状RNA使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默

目的构建低氧诱导因子HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体，观察发夹状双链小干涉RNA对骨肉瘤细胞HIF-1的转录后的基因沉默效果?方法体外合成两对互补的寡核苷酸链，分别针对缺氧诱导因子HIF-1αmRNA序列的两个靶位点。退火形成双链，插入pSilencer^TM neoU62．1真核表达载体。将构建好的载体经脂质体介导转染骨肉瘤SaOS-2细胞，观察HIF-lα基因的沉默效果。半定量RT—PCR检测HIF-1αmRNA的抑制程度，免疫荧光和免疫印迹(Western Blot)检测HIF-1α蛋白表达情况。结果测序证实成功构建HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体。转录生成的发夹状小干涉能够特异抑制HIF-1α表达。RT—PCR结果显示针对HIF-1αmRNA序列的两个靶位点的沉默效果分别为69％和92％，免疫荧光显示转染后荧光强度显著降低，免疫印迹显示两个靶位点的发夹状小干涉RNA分别使HIF-1α蛋白表达下降66％和90％。结论通过体内转录生成的发夹状小干涉RNA能够使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默。     

HIF-1a对恶性肿瘤发展及多药耐药调控机制的研究进展

低氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor—1a,HIF-1a）近年来被广泛研究和报道为肿瘤发生和发展的重要生化指标,它具有调控肿瘤血管生成和糖酵解的能力。最近研究发现,HIF-1a．能够促进恶性肿瘤的转移,并与肿瘤多药耐药性形成有十分密切的关系。     

Effect of hypoxia on 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea cytotoxicity in 9L cells

The cytotoxic effects of 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU) on 9L rat brain tumor cells were studied under oxic and hypoxic conditions. Acute hypoxia was produced by gassing exponentially growing monolayer cells with 95% nitrogen/5% CO2 for 2 h, after which cells were treated with graded concentrations of BCNU for 1 h. Cell survival was assayed with a colony forming-efficiency assay and the extent of DNA cross-linking was measured with the alkaline elution assay. BCNU was more cytotoxic to hypoxic than to oxic cells. There were far more interstrand cross-links formed in hypoxic than in oxic cells, and the number of cross-links could be measured readily in hypoxic cells at very low concentrations of BCNU. This allowed cell survival and cross-linking to be compared at the same dose levels, a correlation not possible for oxic cells in which cross-links are not measurable at low doses. The total intracellular levels of glutathione were lower in hypoxic cells, but the reduced glutathione levels may not be related to the enhanced cell kill because survival of oxic cells treated with BCNU was not affected when cells were depleted of glutathione with buthionine sulfoximine. These results indicate that the additional cell kill produced in 9L cells under hypoxic conditions is related to increased cross-link formation.     

肿瘤血管生长和缺氧诱导因子

缺氧诱导因子(XIF-1)是由α、β两个亚单位形成的二聚体,其中的HIF-lα受缺氧或低糖的调节,它通过与靶基因特定序列DNA结合而调控它们的转录,这些基因包括VEGF、Epo和其他的一系列与机体氧代谢有关的基因.本文就HIF与VEGF的调控及与肿瘤新生血管形成的关系综述如下.     

Observation of incipient tumor angiogenesis that is independent of hypoxia and hypoxia inducible factor-1 activation

It is well established that hypoxia potently stimulates tumor angiogenesis by activating hypoxia inducible factor-1 (HIF-1)-induced proangiogenic factors, such as vascular endothelial growth factor. However, very little is known about the role of hypoxia in incipient angiogenesis in avascular tumors during their early stages of growth. To noninvasively investigate the functional significance of hypoxia and HIF-1 activation in incipient tumor angiogenesis, we genetically engineered HCT116 human colon carcinoma cells and 4T1 mouse mammary carcinoma cells with constitutively expressed red fluorescence protein as a tumor marker and green fluorescence protein (GFP) as a reporter for hypoxia and HIF-1 activation. The accuracy of GFP fluorescence in reporting hypoxia was confirmed by flow cytometry analysis and by immunohistochemical comparison with pimonidazole, a well-established hypoxia marker drug. Mouse dorsal skin-fold window chambers showed that incipient angiogenesis preceded a detectable level of hypoxia. The detectable levels of hypoxia were spatially and temporally related with more intensive secondary angiogenesis following the initial onset of new vessel formation. Selective killing of hypoxic cells by tirapazamine efficiently eliminated or delayed the detection of hypoxic cells, but it did not significantly delay the onset of incipient angiogenesis. These findings provide the first in vivo evidence that incipient tumor angiogenesis may not depend on hypoxia or HIF-1 activation. This is in contrast to the clear role of hypoxia in driving angiogenesis once initial tumor microvessel formation has occurred.