微振动在骨髓间充质干细胞成骨向分化中的作用机制研究进展

微振动是指系统相对平衡位置幅度很小的周期性偏离,而高频率、低振幅的微振动(low-magnitude high-frequency vibration, LMHFV)对骨骼系统细胞的作用力与肌肉运动时对骨骼产生的力学刺激相似。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作为力学敏感细胞,存在于骨髓基质,具有多向分化潜能。在体外适当机械刺激下,BMSCs增殖、分化等生物学特性发生功能性变化,对力学刺激做出适应性应答。LMHFV可促进BMSCs向成骨细胞分化,探明其机制有助于将微振动应用于骨质疏松、骨折、成骨不全症、肥胖症等疾病的治疗以及正畸牙移动的加速等方面。综述微振动对BMSCs成骨向分化的影响以及可能的作用机制,为研究微振动刺激下BMSCs的力学生物学改变提供思路。     

持续张应力大鼠骨髓基质干细胞 骨向分化影响的基因芯片分析

目的 通过基因芯片技术研究持续张应力作用下大鼠骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）成骨分化中基因表达差异。方法 体外分离及培养大鼠BMSCs,使用Flexercell应力加载系统进行频率1 Hz、幅度10 %持续张应力加载6 h。检测持续张应力下大鼠BMSCs差异表达基因谱,并通过qRT-PCR对部分芯片结果进行验证。结果 加力组与对照组相比差异表达基因共有1 244条,其中上调基因793条,下调基因451条。基因本体论（gene ontology, GO）分类发现差异表达基因主要涉及多器官发育、细胞分化、细胞趋化、黏附等功能。Notch、Wnt、FGF及IGF 4条通路可能参与力学诱导下BMSCs成骨分化过程。差异表达基因的PCR验证结果与芯片结果保持一致。结论 张应力可诱导BMSCs骨向分化,而基因芯片筛选出的差异表达基因可能是力学刺激诱导骨向分化的作用靶点。     

骨髓间充质干细胞机械刺激成骨的记忆效应

背景：骨髓间充质干细胞作为组织工程的理想种子细胞,已证实力学刺激有引导其分化的作用。研究表明,干细胞存在着机械记忆,即力学刺激所引起的改变可能会长期影响干细胞的命运。目的：观察骨髓间充质干细胞对力学刺激的记忆效应,解析其发生的表观遗传学机制。方法：(1)分离原代小鼠骨髓间充质干细胞,检测其三系分化能力,传至第3代待用;(2)利用拉伸仪,体外给予小鼠骨髓间充质干细胞机械刺激,检测细胞拉伸前后的成骨分化情况;(3)流式细胞仪检测拉伸后细胞干性;(4)将拉伸处理与未处理的细胞消化后铺种在常规12孔板,继续培养14 d后检测细胞的成骨分化情况;(5)免疫荧光染色检测并筛选造成干细胞机械记忆的关键组蛋白修饰变化,初步明确表观遗传调控的可能机制。结果与结论：(1)5%形变,0.5 Hz,6 h/d,为期7 d的机械刺激可以引导小鼠骨髓间充质干细胞向成骨方向分化;(2)重新铺种培养皿后,拉伸处理后的细胞仍能保持干性且继续向成骨方向分化;(3)结果显示,骨髓间充质干细胞对机械刺激存在记忆效应,这种效应可能与力学刺激导致的组蛋白H3K4me3修饰有关。     

骨髓间充质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶基因表达含量的变化

目的:提取鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行成骨诱导并对BMSCs成骨分化过程中碱性磷酸酶(ALP)的表达量进行定量监测,揭示BMSCs在成骨分化过程中活性的变化。方法:采用全骨髓贴壁法提取鼠BMSCs,培育、扩增至第3代时,以地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C为主要成分配制诱导培养基进行成骨诱导3周。在成骨诱导过程中,通过实时荧光定量(qRT-PCR)探针法对目标细胞的ALP表达量进行实时监测。结果:成骨诱导BMSCs,经显微镜观察、ALP染色、矿化结节染色等检测方法证实诱导成功。qRT-PCR实时检测的ALP表达量在1周后快速上升并维持1周的高值,2周后快速下降至初始值。结论:采用全骨髓贴壁法提取、培养的BMSCs,利用经典的成骨诱导方法可分化为成骨细胞。成骨分化过程中,目标细胞的成骨活性1周后开始快速增强,并可在高水平维持1周,2周后活性开始下降。     

去势大鼠骨量丢失过程中骨髓间充质干细胞的增殖分化功能

目的: 研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖分化功能在去势大鼠骨质疏松发病过程中对骨量丢失的作用。方法: 选用10周龄健康雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术(OVX),建立骨质疏松症(OP)的动物模型;选用同一批次、周龄相同、体重相近的健康雌性SD大鼠行双侧卵巢附近脂肪组织部分切除术,建立假手术(sham)组,假手术大鼠组(sham group)。采用离心法、贴壁法和有限稀释法分离、培养、纯化大鼠BMSCs,体外培养传至3~4代后用于实验:流式细胞术进行BMSCs表型鉴定;克隆形成实验检测BMSCs增殖状况;MTT法测定BMSCs生长曲线;成脂诱导后脂滴油红O染色法检测比较2组大鼠BMSCs成脂能力;成骨诱导后钙化结节茜素红染色法检测比较2组大鼠BMSCs成骨能力;RT-PCR法检测大鼠BMSCs成骨相关蛋白Runx2、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)mRNA的表达。结果: 与sham组大鼠BMSCs相比,OVX组大鼠BMSCs克隆形成能力减弱,增殖能力降低,成脂向分化增强,成骨向分化减弱(P<0.05)。结论: 去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs增殖及成骨分化减弱,成脂分化增强;这导致去势大鼠快速的骨量丢失,在去势大鼠OP发病过程中发挥着重要作用。     

流体剪应力在骨髓基质干细胞成骨向分化中作用机制的研究进展

细胞在体内受到流体剪应力、机械应变、流体静压力等机械应力的作用,其中流体剪应力(fluid shear stress,FSS)被认为是维持骨稳态及骨改建过程中最重要的应力。目前研究多集中在FSS对骨细胞及成骨细胞的作用上,骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的研究相对较少。BMSCs对骨改建及治疗具有重要的意义,BMSCs对FSS的应答越来越受到关注。BMSCs对FSS的反应涉及细胞骨架、基质刚度及弹性、成骨信号等方面。总结FSS在BMSCs内的力转导机制、对其分化及功能的改变等方面的研究进展,为今后构建组织工程化骨、骨病变的治疗等研究提供思路。     

自噬在破骨细胞分化过程中的调控作用

破骨细胞在骨吸收过程中发挥着重要作用,其形成和功能失调可参与骨质疏松、类风湿性关节炎等多种骨相关疾病的发生。破骨细胞的形成和分化是一个复杂的生物学过程,其调控机制尚未完全明了。本研究旨在探讨自噬在破骨细胞分化过程中的作用。在RANKL刺激下,小鼠巨噬细胞RAW264.7可被诱导分化为破骨细胞。本研究采用TRAP染色法检测RAW264.7细胞向破骨细胞分化进程中抗酒石酸酸性磷酸酶活性变化,并通过Western blotting技术检测分析自噬相关蛋白LC3表达变化;并应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)明确自噬在破骨细胞分化中的作用。30ng/ml的RANKL刺激RAW264.7细胞至第5d时可观察到分化成熟的破骨细胞。在此过程中,RANKL刺激至第3d时细胞自噬作用显著增强,此后(如第5d时)自噬作用则逐渐减弱。在分化过程中如果以3-MA抑制细胞的自噬,RAW264.7细胞向破骨细胞的分化则可被显著抑制。可见,自噬在RANKL介导的破骨细胞分化成熟的过程中发挥重要的调控作用,抑制自噬则阻碍破骨细胞的分化成熟。     

力学刺激通过microRNA调控骨重建的研究进展

骨骼结构完整性和骨量的维持需要一定的力学刺激。研究表明,力学刺激可通过调控多种调节因子(例如激素、转录因子和信号分子等)参与骨重建过程。力学刺激可以通过调控微小RNA(microRNA,miRNA)表达在骨重建过程中起着至关重要的作用。然而,受力学刺激调控的miRNA在骨重建过程中的作用和机制尚不完全清楚。本文综述受力学刺激调控的miRNA在骨重建过程中的作用及其机制,并强调其在治疗骨质疏松中的潜在应用。     

微环境通过细胞骨架张力对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是微环境中为细胞提供力学线索的主要元件。干细胞对基质力学信号改变的响应主要通过细胞骨架实现。细胞外基质性能改变后，力学信号经信号复合体传递，细胞骨架作为贯穿细胞整体的网状支架结构，在分子马达的作用下纤维重组产生张力，该力学信号可以转导为化学信号或直接传递至细胞核骨架，产生一系列对干细胞干性、增殖、分化以及凋亡的影响。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）对于骨改建和治疗具有重要的意义。总结微环境改变后细胞骨架张力在BMSCs成骨分化过程中的影响及力信号响应机制。     

Osteogenic differentiation of bone marrow MSCs by β-tricalcium phosphate stimulating macrophages via BMP2 signalling pathway

Immune reactions play important roles in determining the in vivo fate of bone substitute materials, either in new bone formation or inflammatory fibrous tissue encapsulation. The paradigm for the development of bone substitute materials has been shifted from inert to immunomodulatory materials, emphasizing the importance of immune cells in the material evaluation. Macrophages, the major effector cells in the immune reaction to implants, are indispensable for osteogenesis and their heterogeneity and plasticity render macrophages a primer target for immune system modulation. However, there are very few reports about the effects of macrophages on biomaterial-regulated osteogenesis. In this study, we used β-tricalcium phosphate (β-TCP) as a model biomaterial to investigate the role of macrophages on the material stimulated osteogenesis. The macrophage phenotype switched to M2 extreme in response to β-TCP extracts, which was related to the activation of calcium-sensing receptor (CaSR) pathway. Bone morphogenetic protein 2 (BMP2) was also significantly upregulated by the β-TCP stimulation, indicating that macrophage may participate in the β-TCP stimulated osteogenesis. Interestingly, when macrophage-conditioned β-TCP extracts were applied to bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), the osteogenic differentiation of BMSCs was significantly enhanced, indicating the important role of macrophages in biomaterial-induced osteogenesis. These findings provided valuable insights into the mechanism of material-stimulated osteogenesis, and a strategy to optimize the evaluation system for the in vitro osteogenesis capacity of bone substitute materials.     

microRNA-146a mediates distraction osteogenesis via bone mesenchymal stem cell inflammatory response

Distraction osteogenesis (DO) is a widely used surgical technique to repair bone defects, partly owing to its high efficiency in inducing osteogenesis; however, the process of osteogenesis is complex, and the precise mechanism is still unclear. Among the factors identified for an effective DO procedure, well-controlled inflammation is essential. We aimed to explore how microRNA(miR)?146a, a negative regulator of inflammation, influences osteogenesis in DO. First, we established canine right mandibular DO and bone fracture models to evaluate the expression level of miR-146a in response to these procedures. Second, bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated from healthy puppies and cultured with lipopolysaccharide (LPS) to observe how inflammation affects osteogenesis. Finally, the osteogenesis activity of BMSCs transfected with lentiviral vector either overexpressing (miR-146a-up) or inhibited for miR-146a expression was evaluated. miR-146a-up-transfected BMSCs were injected locally into the distraction gaps of the DO model canines. On days 42 and 56 post-surgery, the bone volume/tissue volume and bone mineral density values were evaluated via using micro-computed tomography, and newly formed tissues were harvested and evaluated via histological staining. The expression of miR-146a in both the DO canine model and LPS-stimulated BMSCs increased. Overexpression of miR-146a enhanced cell proliferation, migration, and osteogenic differentiation. Additionally, the newly formed callus was improved in canine mandibles injected with miR-146a-up-transfected BMSCs. In summary, miR-146a regulates mandibular DO by improving osteogenesis, and can serve as a potential target to shorten the therapy period of DO.     

骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究

本实验观察了骨髓基质细胞(BMSCs)经化学诱导向神经细胞分化的过程,并初步探索其分化机制。首先分离培养扩增纯化SD大鼠BMSCs,应用β-巯基乙醇(BME)对第4代BMSCs进行诱导分化,分化稳定后撤除诱导液继续常规培养2周。结果显示:诱导分化前,细胞呈现梭形,平行排列生长。诱导分化后,多数BMSCs伸出突起,并发出初级和次级分支,相互交织成网状结构,成典型的神经元样细胞形态,分化过程中有部分细胞漂浮死亡。撤除诱导液常规培养2周后,分化的细胞逐渐缓慢恢复到原来成纤维细胞样长梭状形态。透射电镜观察到分化后细胞具有发育早期神经元的超微结构特点,免疫组织化学方法证实,神经干细胞标志蛋白(Nestin)在诱导分化后即开始表达,1h达到高峰,此时Nestin阳性细胞率为(29.35±1.45)%,之后随时间逐渐下降,5h时降至很低;神经元细胞标志蛋白-神经元特异性烯醇化酶(NSE)在诱导分化前不表达,在诱导分化后随时间表达逐渐增强,5h时阳性细胞率最高为(57.53±2.63)%;撤除诱导液常规培养2周时,Nestin、NSE表达均为阴性。星形胶质细胞标志蛋白-胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein GFAP)测定在不同组、不同时间点均为阴性结果。提示,BMSCs体外经BME化学诱导可向神经元样细胞分化,不能分化为胶质细胞;分化机制可能是先分化为神经干细胞,再转分化为神经元样细胞,这一化学分化过程是迅速、短暂、可逆的,且对细胞有损伤,因此,化学诱导后的BMSCs不适宜做细胞疗法的种子细胞。     

血管化人工骨的体外构建和体内异位成骨

背景：血管化在骨形成和改建中起重要作用,目前大的组织块难以获得充足的氧气和营养供应,因此组织工程中就出现了需要适当血管化的问题。 目的：建立体外血管化人工骨模型并且体内异位成骨的实验体系。 方法：分离培养鼠骨髓间充质干细胞和肾血管内皮细胞,体外构建鼠骨髓间充质干细胞和鼠肾血管内皮细胞直接接触培养血管化人工骨组,以间接接触三维培养体系和两种细胞单独培养体系作为对照。体外通过测定蛋白质含量,碱性磷酸酶活性和骨钙素,分析骨髓间充质干细胞在不同混合培养模型中的成骨能力。建立鼠骨髓间充质干细胞和肾血管内皮细胞的三维培养体系,再将两种细胞直接接触组材料和骨髓间充质干细胞单独培养组的材料分别植入鼠左右腿肌肉内,通过软X射线摄影和苏木精-伊红染色检测分析不同植入方法的血管形成和成骨能力。 结果与结论：当两种细胞混合培养时,具有很好的细胞兼容性。两种细胞单独培养碱性磷酸酶活性和骨钙素较间接接触混合培养降低,而两种细胞混合培养时,体系中碱性磷酸酶活性和骨钙素水平增加。动物实验结果显示在混合培养体系中的骨髓间充质干细胞的成骨能力高于单独培养(P < 0.05)。体内实验表明在血管化人工骨中的软X射线骨密度,血管数量和新形成的骨量均高于对照组(P < 0.05)。提示在两种细胞混合培养时骨髓间充质干细胞的成骨能力可以被细胞因子和细胞膜蛋白质调节,和传统的人工骨比较,血管化人工骨有加速骨髓间充质干细胞分化,增加了局部的血管微循环生存率,以及加速成骨和更好的抗感染能力。