硼替佐米诱导ABCG_2~(High)耐药鼻咽癌细胞高表达NKG2D配体的实验研究

目的 探讨硼替佐米诱导高表达ABCG2耐药鼻咽癌细胞对Allo-NK细胞杀伤敏感性的机制.方法 利用免疫磁珠技术分离ABCG2High CNE2/DDP细胞及Allo-NK细胞,流式细胞技术检测分离后细胞纯度及经硼替佐米处理前后靶细胞NKG2D配体表达率,LDH释放测定法检测经硼替佐米处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性.结果 ABCG2HighCNE2/DDP细胞分离后ABCG2表达率为(91.40±2.32)%,分选后NK细胞CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上.经硼替佐米处理之后靶细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率,由药物处理之前的(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别上升到(17.52±2.04)%、(12.53±3.68)%、(15.24±2.91)%、(62.02±6.85)%、(35.69±3.23)%.在效靶比为10:1、20:1、Allo-NK细胞对硼替佐米处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞的杀伤率分别为(15.32±13.86)%、(27.26±6.81)%及(35.06±5.10)%、(52.34±4.78)%.处理前后杀伤率差异有统计学意义(F=26.03,P=0.000).结论 硼替佐米通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP1-3),使肿瘤细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性增强.     

分子靶向药物诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达

目的：探讨不同分子靶向药物对高表达与低表达ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ATPbinding cassette superfamily G member 2,ABCG2）的人耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞（分别简写为ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP）表面NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands, NKG2DLs）表达的诱导作用及其对NK细胞杀伤敏感性的影响。方法：免疫磁珠法分选ABCG2 highCNE2/DDP、ABCG2lowCNE2/DDP细胞及NK细胞。流式细胞术检测分选细胞的纯度和不同分子靶向药物（硼替佐米、索拉非尼、舒尼替尼）处理前后ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达率。LDH释放法检测不同药物处理前后ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性。结果：ABCG2 highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞表面ABCG2的表达率分别为（91.40±2.32）%和（1.70±0.24）%。分选后NK细胞中CD3-CD16+CD56+细胞的比例达90%以上。药物处理前,ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3呈弱表达;经不同分子靶向药物处理后,5种NKG2DLs的表达率均明显上升(P<001),以舒尼替尼处理后NKG2DLs的表达率升高最明显。随着NKG2DLs表达的上调,ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性也随之升高。结论：不同分子靶向药物可诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,以舒尼替尼的诱导作用最强,且肿瘤细胞NKG2DLs的表达与其对NK细胞杀伤敏感性之间存在线性关系。     

苹果酸舒尼替尼诱导高表达三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2的耐药鼻咽癌细胞高表达NKG2D配体

目的:探讨苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate, SU11248)对高表达三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2)耐药鼻咽癌细胞CNE2/DDP(ABCG2high CNE2/DDP)表达NKG2D配体的诱导作用.方法:利用免疫磁珠技术分离ABCG2highCNE2/DDP细胞及同种异体反应性自然杀伤细胞(allo-reactive natural kill cell, Allo-NK),流式细胞技术检测分离后细胞的纯度及苹果酸舒尼替尼处理前后ABCG2highCNE2/DDP细胞NKG2D配体表达率,LDH释放测定法检测苹果酸舒尼替尼处理前后ABCG2highCNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性.结果:ABCG2highCNE2/DDP细胞分离后ABCG2的表达率为(91.40±2.32)%,Allo-NK细胞分选后CD3-CD16 CD56 细胞的纯度达90%以上.经苹果酸舒尼替尼处理后,ABCG2highCNE2/DDP细胞的NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达率由药物处理之前的(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别上升到(89.12±4.56)%、(66.10±2.22)%、(67.56±4.19)%、(69.37±8.83)%、(63.28±3.31)%.在效靶比为10∶1、20∶1时,苹果酸舒尼替尼处理前后Allo-NK细胞对ABCG2highCNE2/DDP细胞的杀伤率分别为(15.32±13.86)%、(27.26±6.81) % 及(41.12±4.12)%、(57.25±2.37)%,处理后的杀伤率有明显的提高(F=15.58, P＝0.000).结论:苹果酸舒尼替尼通过诱导高表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP1-3),使ABCG2high CNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性明显增强.     

顺铂对鼻咽癌细胞NKG2D配体表达和NK细胞杀伤活性的增强作用

 目的 研究顺铂(Cisplatin, DDP)作用前后人鼻咽癌细胞CNE2 NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子表达的改变及NK细胞杀伤活性的变化。 方法 MTT法测定DDP对CNE2细胞的50%抑制量（IC₅₀）;以此浓度DDP作用CNE2细胞24h,乳酸脱氢酶释放法检测效靶比20∶1时,NK细胞对DDP作用前后的CNE2细胞的杀伤活性;流式细胞仪检测DDP作用前后的CNE2细胞表面NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULBP2、 ULBP3)和HLA-Ⅰ类分子表达的变化。 结果 DDP对CNE2细胞的IC₅₀为5mg/L。效靶比20∶1时,NK细胞对5mg/L DDP作用前后的CNE2细胞的杀伤活性分别为 （38.11±1.41）%,（47.71±1.53）%,差异有统计学意义（P＜0.05）,DDP作用后CNE2细胞表面MICA/B、ULBP1、 ULBP3表达显著升高,与作用前相比差异有统计学意义（P＜0.05）。ULBP2、HLA-Ⅰ类分子无明显变化(P＞0.05)。 结论 DDP能提高CNE2细胞NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULBP3)的表达,从而增强CNE2细胞对NK细胞杀伤的敏感度。     

西妥昔单抗对耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞和NK细胞的双重免疫调节作用

目的：探讨西妥昔单抗(cetuximab)对耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）的表达及NK细胞分泌IFNγ的影响。方法：流式细胞术检测高、低表达ABCG2（ATPbinding cassette superfamily G member 2)的耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞（简称ABCG2lowCNE2/DDP细胞和ABCG2highCNE2/DDP细胞）表面EGFR的表达水平,以及西妥昔单抗处理前后两种CNE2/DDP细胞表面NKG2DLs的表达水平。西妥昔单抗处理前后的两种CNE2/DDP细胞分别与NK细胞共培养,ELISA检测上清中IFNγ的分泌水平,LDH释放法检测NK细胞对不同组CNE2/DDP靶细胞的杀伤。结果：ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞表面EGFR的表达率分别为（43.60±2.01）%和（47.20±207）%。西妥昔单抗上调ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞表面MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表达,但下调ABCG2highCNE2/DDP细胞表面ULBP3的表达。西妥昔单抗处理两种CNE2/DDP细胞后,与NK细胞的共培养体系中IFNγ的分泌水平明显上调（P<001）;西妥昔单抗增强两种CNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性（P<0.01）。结论：西妥昔单抗可上调耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,间接刺激NK细胞分泌IFNγ,具有双重免疫调节作用。     

苦参碱对高表达ABCG2人耐药鼻咽癌细胞NKG2D配体表达的诱导作用

目的:探讨苦参碱对高表达三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)人耐药鼻咽癌细胞CNE2/DDP(简写作ABCG2aHighCNE2/DDP)NKG2D配体表达的诱导作用及其对NK细胞杀伤敏感性的机制.方法:利用免疫磁珠技术分离ABCG2HighCNE2/DDP细胞及NK细胞,流式细胞技术检测分离后细胞纯度及经苦参碱处理前后靶细胞NKG2D配体表达率,LDH释放测定法检测经苦参碱处理前后ABCG2HighCNE2/DDPP细胞对NK细胞的杀伤敏感性.结果:ABCG2HighCNE2/DDP细胞分离后ABCG2表达率为(91.40±2.32)%.分选后NK细胞CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上,经苦参碱处理之后靶细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率,由药物处理之前的(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别上升到(11.30±0.89)%、(14.29±2.61)%、(12.56±1.06)%、(43.24±4.43)%、(12.77±1.06)%.在效靶比为10:1、20:1时,NK细胞对苦参碱处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞的杀伤率分别为(15.32±1.34)%、(27.26±6.81)%及(28.53±1.37)%、(42.72±2.80)%.处理前后杀伤率有显著性差异(F=29.05,P=0.000).结论:苦参碱通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP1-3).使肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性增强.     

NKG2D介导NK 细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究

 目的 探讨鼻咽癌CNE2细胞表面HLA-Ⅰ类分子表型和NKG2D配体的表达情况，进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。方法 流式细胞仪检测NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3在K562、CNE2细胞的表达情况。PCR-SSP法分析CNE2细胞HLA-A、B、Cw分型和NK细胞KIR分型。LDH释放法测定5例健康者NK细胞在不同效靶比时对K562、CNE2细胞的杀伤活性，效靶比20：1时观察抗NKG2D配体的单抗对NK细胞杀伤K562、CNE2细胞活性的影响。结果 CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3。K562细胞表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。5例健康者NK细胞抑制性KIR与CNE2细胞表面的HLA-Ⅰ类分子之间存在错配。效靶比5：1、10：1、20：1、30：1时NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性分别为（29．02±0．45）％、（10．50±2．17）％；（44．43±1．36）％、（27．68±1．47）％；（57．82±1．35）％、（36．99±3．13）％：（71．24±2．36）％、（55．00±2．20）％，在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强（P=0．000）；在效靶比20：1时anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP1、anti—ULBP2、anti-ULBP3可明显抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显著性差异（P=0．000）；anti—MICA、anti—MICB、anti—ULBP2可明显抑制NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显著性差异（P〈0．01），但anti—ULBP1、anti—ULBP3不能阻断NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。结论 NKG2D配体影响NK细胞对靶细胞的杀伤活性，提高NKG2D配体的表达有可能提高NK细胞的抗肿瘤活性。     

舒尼替尼体内诱导耐药鼻咽癌细胞表达NKG2DLs增强NK细胞的抑瘤作用

目的：探讨体内条件下舒尼替尼对耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs（natural killer group 2 member D ligands)表达的诱导作用,及其对NK细胞抗肿瘤活性的影响。方法：建立ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分如下8组：A、E组分别接种ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞,B、F组分别接种舒尼替尼处理的ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞,C、G组分别接种ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞后再输注NK细胞;D、H组接种舒尼替尼处理的ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞后再输注NK细胞。检测各组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积和抑瘤率。免疫组织化学法检测移植瘤组织中NKG2DLs的表达。结果：A、B、C、D和E、F、G、H组肿瘤出现时间分别为(5.43±1.00)、(8.50±035)、(1110±1.25)、(13.56±1.23) d和 (9.00±1.00)、(12.30±0.78)、(14.50±0.50)、(17.25±0.77) d,其中舒尼替尼与NK细胞联合处理组（D 和H 组）成瘤时间最晚（P<0.01）。A、B、C、D和E、F、G、H组肿瘤质量分别为(2.63±089)、(1.00±003)、(065±0.08)、(0.21±0.27) g和(2.79±0.83)、(1.18±0.77)、(0.96±0.50)、(0.86±0.82) g,其中舒尼替尼与NK细胞联合处理组肿瘤质量最小（P<001）;舒尼替尼与NK细胞联合处理的D组和H组的抑瘤率分别为92%和69%。舒尼替尼上调移植瘤组织中NKG2DLs的表达,且ABCG2highCNE2/DDP细胞移植瘤中的NKG2DLs表达率高于ABCG2lowCNE2/DDP细胞。结论：舒尼替尼可在体内诱导CNE2/DDP移植瘤组织表达NKG2DLs,增强NK细胞的抗肿瘤作用。     

舒尼替尼诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞表达NKG2DLs的机制

目的：初步探讨舒尼替尼诱导高、低表达ABCG2(ATPbinding cassette superfamily G member 2)分子的耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞（简称ABCG2highCNE2/DDP细胞、ABCG2lowCNE2/DDP细胞）中NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）表达的分子机制。方法：Caspase8活化试剂盒和线粒体膜电位法分别检测NK细胞处理后ABCG2highCNE2/DDP细胞和ABCG2lowCNE2/DDP细胞caspase8活化水平和线粒体膜电位。RTPCR检测舒尼替尼处理前后两种CNE2/DDP细胞DNA损伤修复系统相关信号分子mRNA的表达。结果：CNE2/DDP细胞+NK细胞组中两种CNE2/DDP细胞caspase8活性均明显增强;舒尼替尼处理后的ABCG2low CNE2/DDP细胞+NK细胞组和ABCG2highCNE2/DDP细胞＋NK细胞组中caspase8的活性是处理前的2～2.5倍（P<0.01）。舒尼替尼预处理后,CNE2/DDP细胞和NK细胞共培养体系中两种CNE2/DDP细胞的线粒体膜电位分别为(76.58±2.32)%和(73.11±1.93)%,较舒尼替尼处理前明显降低（P<0.05）。舒尼替尼可上调两种CNE2/DDP细胞中ATR、CHK1和CHK2 mRNA的表达,并诱导P53和NFκB mRNA的表达。结论：舒尼替尼可能通过激活DNA损伤修复系统相关信号分子和NFκB的表达,诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,同时经由死亡受体信号通路和线粒体信号通路增强NK细胞诱导的肿瘤细胞凋亡。     

硼替佐米提高耐药K562/ADM细胞对NK细胞杀伤的敏感性及其机制

目的:探讨硼替佐米提高耐药K562/ADM细胞对NK细胞杀伤敏感性的可能机制.方法:流式细胞术和real-time PCR检测硼替佐米处理前后K562/ADM细胞表面MHC Ⅰ类链相关分子A(major histocompatibility complex class Ⅰ chainrelated molecule A,MICA)蛋白和mRNA的表达,LDH释放法检测硼替佐米处理前后K562/ADM细胞对NK细胞的杀伤敏感性.结果:硼替佐米处理后,K562/ADM细胞表面MICA蛋白表达率上升[(17.03 ±4.94)％vs(23.77±5.26)％,P＜0.05];处理后K562/ADM细胞MICA mRNA的表达水平是处理前的(2.03±0.33)倍.效靶比为10∶1、20∶1时,NK细胞对硼替佐米处理后的K562/ADM细胞的杀伤率上升[(23.22±3.03)％、(30.30±0.74)％ vs(33.69±1.28)％、(41.40 ±1.97)％,P＜0.05].结论:硼替佐米提高耐药K562/ADM细胞对NK细胞杀伤的敏感性,其机制可能与硼替佐米上调K562/ADM细胞MICA表达有关.     

顺铂和氟尿嘧啶增强食管癌细胞NKG2D配体的表达及CIK细胞的杀伤活性

目的研究顺铂(Cisplatin,DDP)和氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）对人食管癌EC9706 细胞NKG2D配体表达及CIK细胞杀伤活性的影响。方法MTT法测定DDP、5-Fu的50%抑制浓度（IC50）;以1/2 IC₅₀浓度DDP、5-Fu作用EC9706细胞72 h,RT-PCR检测DNA损伤修复系统相关信号分子的表达。流式细胞仪检测DDP、5-Fu作用前、后EC9706细胞NKG2D配体的表达。乳酸脱氢酶释放法检测效靶比20∶1时,CIK细胞对DDP、5-Fu作用前、后EC9706细胞的杀伤活性。结果DDP、5-Fu的IC₅₀分别为5 μg/ml、10 μg/ml。DDP、5-Fu可上调DNA损伤修复系统相关信号分子mRNA的表达。DDP与 EC9706细胞共孵育72 h后,EC9706细胞MICA、MICB、ULBP2、ULBP3表达较DDP作用前明显增强（P<0.05）,ULBP1无明显变化（P>0.05）。5-Fu与 EC9706细胞共孵育72 h后,EC9706细胞MICA、ULBP2、ULBP3表达明显增强（P<0.05）,MICB、ULBP1无明显变化（P>0.05）。效靶比20∶1时,CIK细胞对EC9706细胞的杀伤活性为（37.08±0.62）%,CIK细胞对1/2 IC₅₀ DDP、1/2 IC₅₀ 5-Fu作用后的EC9706细胞杀伤活性分别为（59.33±2.10）%、（52.44±0.97）%,与作用前相比差异均有统计学意义（P<0.05）。结论DDP、5-Fu通过激活DNA损伤修复系统相关信号分子,提高EC9706细胞NKG2D配体的表达,从而增强EC9706细胞对CIK细胞杀伤的敏感度。     

去甲斑蝥素联合IL-12、IL-15处理增强PBMC对Raja细胞的杀伤效应【创新点评：中药抗癌药物去甲斑蝥素增强PBMC对淋巴瘤的杀伤－郑胡镛】

目的:探讨细胞因子IL-2、IL-15激活的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)对去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)处理后的人Burkitt淋巴瘤Raji细胞的杀伤效应及其可能机制.方法:锥虫蓝拒染法检测NCTD对Raji细胞和PBMC细胞增殖的影响;LDH释放法检测IL-2、IL-15激活后的PBMC对K562细胞和Raji细胞的杀伤;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测IL-2、IL-15诱导后PBMC表面NKG2D的表达,以及NCTD作用前后Raji细胞表面NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达.结果:NCTD抑制Raji细胞的增殖,具有剂量、时间依赖性(P＜0.05),但对PBMC增殖无影响(P＞0.05).在效靶比为10∶1、20∶1时,IL-2、IL-15激活的PBMC对K562细胞的杀伤率较未激活的PBMC明显增高[(52.42±3.89)％vs (15.82±5.12)％,(79.55±9.22)％vs(27.67±3.66)％,P＜0.05];PBMC对NCTD处理后Raji细胞杀伤率较未经NCTD处理的Raji细胞明显增高[(23.63±6.20)％vs (5.04±1.25)％,(41.80±4.09)％ vs (8.59±2.19)％;P＜0.05],且IL-2、IL-15激活的PBMC对NCTD处理后Raji细胞的杀伤率较NCTD处理前明显提高[(38.97±2.76)％ vs(13.19±3.67)％,(63.09 ±7.30)％ vs(19.89 ±4.15)％;P＜0.05].激活后PBMC表面NKG2D表达率升高[(44.91±5.85)％vs (25.28±7.69)％,P＜0.05].NCTD作用后Raji细胞表面NKG2D的配体ULBP2表达显著升高[(12.69±3.99)％vs(1.03 ±0.42)％,P＜0.05],而其他配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP3的表达无明显变化(P＞0.05).结论:NCTD联合细胞因子IL-2、IL-15处理能增强PBMC对Raji细胞的杀伤效应,其机制与NCTD上调Raji细胞表面ULBP2表达和细胞因子上调PBMC表面NKG2D表达有关.     

As2S2对人卵巢癌耐药株C13K/DDP细胞增殖和凋亡的作用

 目的：研究As₂S₂对卵巢癌耐药株C13K/DDP细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用。方法：以 不同浓度(4、6、8、10μmol/L)的As2S2,分三个时间点(24、48、72h)干预C13K/DDP细胞,采用 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测As2S2对C13K/DDP细胞的增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋 亡率;Western blot检测BCL-2、BAX、AKT的表达。结果：MTT结果显示不同浓度(4、6、8、10 μmol/L)的As₂S₂作用C13K/DDP细胞后,与DDP组相比其增殖受到抑制,作用呈明显的时效和量效 关系,差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞仪的结果显示6、8μmol/L As₂S₂诱导细胞的24h凋 亡率分别为(16.05 ±2）%、( 22.30±3）%,DDP组为(9.45 ±2)%,对照组为( 7.82±1.2)% ;6、8μmol/L As₂S₂诱导细胞48h凋亡率分别为(28.94 ±1.8）%、(37.85 ±3）%,DDP组为 （14.74±3.2）%,对照组为( 9.80±2.6）%,各组比较,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示BCL-2、AKT表达下调,BAX表达明显上调。结论：As₂S₂对人卵巢癌耐药株 C13K/DDP细胞具有增殖抑制和诱导凋亡的作用,可能与BCL-2下调、BAX上调或AKT下调有关。