日本血吸虫雄虫免疫血清对成虫cDNA文库的筛选及克隆分析

目的　筛选和分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新基因 ,为血吸虫疫苗研究提供新的候选分子。 方法　以日本血吸虫雄性成虫抗原免疫兔血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR鉴定及测序分析。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白的结构与功能。结果　筛选获 11个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 7～ 2 3kb之间。对部分阳性克隆进行测序分析 ,获两个Sj新基因 ,即Sj-MA及Sj -Cp8(登录号分别为AF5 1980 8和AF5 2 4 896 ) ,分别编码 2 4 9和 71个氨基酸的核内蛋白和胞浆蛋白。Sj-MA蛋白含有 9个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N -肉豆蔻酸化位点。Sj-Cp8蛋白含一个跨膜区、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N -肉豆蔻酸化位点。结论　筛选Sj成虫cDNA文库所获得两个新基因 ,其编码的蛋白可能为存在于胞浆和胞核内的日本血吸虫的重要信息传递分子 ,有望成为新的血吸虫病疫苗候选分子。     

日本血吸虫雄虫免疫虫清对成虫cDNA文库的筛选及克隆分析

目的：筛选和分析日本血吸虫（Schistosoma jakponicum,Sj)新基因，为血吸虫疫苗研究提供新的候选分子。方法：以日本血吸虫雄性成虫抗原免疫兔血清为探针，筛选Sj成虫cDNA文库，对阳性克隆的插入片段进行PCR鉴定及测序分析。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析，并预测新基因编码蛋白的结构与功能。结果：筛选获11个阳克隆，其插入Sj cDNA片段大小在0．7－2．3db之间。对部分阳性克隆进行测序分析，获两个Sj新基因，即Sj-MA及Sj-Cp8(登录号分别为AF519808和AF524896），分别编码249和71个氨基酸的核内蛋白和胞浆蛋白。Sj-MA蛋白含有9个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，2个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个N－肉豆蔻酸化位点。Sj-Cp8蛋白含一个跨膜区、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N－肉豆蔻酸化位点。结论：筛选Sj成虫cDNA文库所获得两个新基因，其编码的蛋白可能为存在于胞浆和胞核内的日本血吸虫的重要信息传递分子，有望成为新的血吸虫病疫苗候选分子。     

日本血吸虫三个新跨膜蛋白基因的克隆和分析

目的　克隆并分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的抗原基因 ,为血吸虫病防治提供有效的疫苗候选分子。方法　以旋毛虫感染鼠血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对获得的阳性克隆进行PCR鉴定及测序。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果　共筛选出 9个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 .6～ 2 .1kb之间。测序分析获 5个新基因 ,其中Sj Ts1,Sj Ts3及Sj Ts5 (登录号为AY0 0 5 816 ,AF2 990 80 ,AY0 2 4 35 2 )分别编码 83,83,2 33个氨基酸组成的跨膜蛋白。Sj Ts1蛋白含 1个潜在的跨膜区 ,2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。Sj Ts3蛋白含两个跨膜区 ,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。Sj Ts5蛋白为具有 5个跨膜区的跨膜蛋白 ,含 1个N 糖基化位点、2个cAMP与cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。结论　Sj Ts1、Sj Ts3与Sj Ts5基因编码的蛋白质均为受磷酸化激活控制的跨膜蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病疫苗候选分子     

大鼠天然抗体相关的弓形虫抗原基因的免疫筛选与克隆

目的　研究大鼠对弓形虫感染的天然抗性分子 ,为弓形虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法　用正常大鼠血清作为探针筛选弓形虫速殖子cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定。结果　从cDNA文库 2× 10 5个噬菌斑中筛选出 5个阳性克隆 ,其插入片段大小分别为 0 5 5～ 1 8kb。对P1、P4、P6和P8四个克隆进行测序 ,将所得序列查询基因序 ,结果显示 :P8与弓形虫棒状体蛋白 2 (ROP2 )基因相同。P4为弓形虫的新基因序列 (GenBank中的登录号为AY34916 2 ) ,命名为T .gP4。T .g -P4编码 96个氨基酸的跨膜蛋白。PROSCAN分析显示T .g -P4含有 4个蛋白激酶C磷酸化位点 ,3个N -肉豆酸酰化位点 ,1个核糖体蛋白L2 9信号。P1和P6为新基因片段。阳性克隆的分子鉴定正在进行中。结论　阳性克隆的筛选和鉴定为抗弓形虫病疫苗的研制奠定基础。     

日本血吸虫雌虫抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库

目的　筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的疫苗候选基因或雌虫性别特异性基因。　方法　用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清 ,对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选 ,将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增 ,采用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆插入子进行测序 ,与GeneBank中的已知序列进行比对分析。　结果　共获得 2 6个阳性克隆 ,其PCR产物大小约 0 .5～ 3kb。在进行测序的 8个阳性克隆中发现了GeneBank未报道的Sj肌球蛋白的部分基因序列 (GeneBank登录号为AY3 2 2 14 8)和 1个新基因 (命名为Sj F1,GeneBank登录号为AY2 61995 )。Sj F1编码的蛋白理论分子质量为 13 .45ku ,等电点为 6.2 9,富含α螺旋和随机卷曲 ,含多个蛋白激酶磷酸化位点 ,1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个豆蔻酸位点。　结论　Sj雌虫免疫血清可识别Sj特异性抗原分子 ,该抗原基因是否为雌虫性别特异性基因及其作为日本血吸虫病疫苗候选基因的价值 ,有待进一步研究。     

日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库与新基因分析

目的　筛选与日本血吸虫尾蚴抗原有共同免疫原性的日本血吸虫成虫抗原分子,为血吸虫病诊断和疫苗研究提供新的候选分子。　方法　利用日本血吸虫尾蚴可溶性抗原免疫兔血清筛选日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)成虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。　结果　共筛选出13个阳性克隆,PCR扩增出特异的插入片段。测序分析获4个新基因SjCAI、SjCA、SjCAI2和SjCAI3(登录号分别为AF495883、AF515834、AY118086和AY129303),分别编码353、161、137和72个氨基酸的蛋白。SjCAI蛋白含6个DNA结合锌指,与原肠胚锌指蛋白XLCGF48.2有一定同源性;SjCA蛋白、SjCAI2蛋白和SjCAI3蛋白含N糖基化和磷酸化位点。　结论　筛选Sj成虫cDNA文库获得了新的基因序列。     

蒿甲醚预防日本血吸虫病诱导的兔特异抗体相关靶抗原编码基因的筛选

目的寻找应用蒿甲醚预防血吸虫后,引起免疫保护作用的抗原分子,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法感染血吸虫7天后的家免口服蒿甲醚,收集血清,用蒿甲醚预防后的免疫免血清筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫 cDNA 文库,并对阳性克隆的插入基因片段进行 PCR 扩增及测序分析。结果经三轮筛选,获8个阳性克隆。测序分折所获的这8个序列,其中5个序列分别与日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Sj GAPDH)基因同源,其余3个序列为日本血吸虫28kD 谷胱甘肽-S-转移酶(Sj.GST)基因。结论 Sj.GAPDH 和 Sj.28kDGST 可能是蒿甲醚杀伤血吸虫后,引起对再感染起免疫保护作用的抗原分子。     

旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 探讨旋毛虫与血吸虫之间交叉免疫的分子机制,并寻找有效的日本血吸虫疫苗侯选分子。方法 以旋毛虫感染鼠血清为探针,筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对获得的阳性克隆插入片段进行PCR扩增。结果 共筛选出11个阳性克隆,其插入的cDNA片段大小在1．4－5．0kb之间,其中1．4kb片段2个,5．0kb片段9个。结论 获得的阳性在隆插入基因片段可能为编码旋毛虫与日本血吸虫共同的抗原基因,其表达产物可能有抗日本血吸虫感染的作用。     

大鼠感染血清免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库

目的为弓形虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法用弓形虫RH株速殖子感染大鼠,分离其血清作为探针筛选弓形虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定。结果从cDNA文库4×105~5个噬菌斑中筛选出13个阳性克隆,其插入片段大小分别为0.45～2.4kb。对L1、L2、L4和L5四个克隆进行测序,将所得序列查询基因库,结果,克隆L2与弓形虫P24主要抗原基因序列相同,L4与蔗糖丙酮酸磷酸激酶具有同源性,L1无任何相匹配的序列,为未曾报告过的新基因(GenBank登录号为AY180109),命名为T.g-R1。T.g-R1编码134个氨基酸的非跨膜蛋白。PROSCAN分析显示T.g-R1含有2个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个肉豆酸酰化位点,1个微体细胞C端靶信号。L5为一小片段,无完整编码读框。结论阳性克隆的筛选和鉴定为抗弓形虫病疫苗的研制提供又一途径。     

日本血吸虫雌虫抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库

目的筛选日本血吸虫(Schistosoma ja ponicum，Sj)新的疫苗候选基因或雌虫性别特异性基因。方法用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清，对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增，采用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆插入子进行测序，与GeneBank中的已知序列进行比对分析。结果共获得26个阳性克隆，其PCR产物大小约0．5～3kb。在进行测序的8个阳性克隆中发现了GeneBank未报道的Sj肌球蛋白的部分基因序列(GeneBank登录号为AY322148)和1个新基因(命名为Sj-F1，GeneBank登录号为AY261995)。Sj-F1编码的蛋白理论分子质量为13．45ku，等电点为6．29，富含α螺旋和随机卷曲，含多个蛋白激酶磷酸化位点，1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点和1个豆蔻酸位点。结论Sj雌虫免疫血清可识别Sj特异性抗原分子，该抗原基因是否为雌虫性别特异性基因及其作为日本血吸虫病疫苗候选基因的价值，有待进一步研究。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位的分离和序列分析

目的　分离和鉴定日本血吸虫 (Schistosomajaponisum ,Sj)新基因。 方法　应用表达序列标签 (Expressedse quencetags ,ESTs)法随机筛选SjcDNA文库 ,通过PCR直接序列测定技术和同源性比较对阳性插入片段进行鉴定。采用亚克隆技术和生物信息学分析对日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录延长因子SⅢ -p15亚单位进行结构和功能的鉴定。结果　我们从SjcDNA文库中随机筛选到一个cDNA克隆 ,它含有一个 371个碱基组成的阅读框 ,编码 118个氨基酸 ,与哺乳动物等的RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位具有较高的同源性 ,且具有该因子所特有的氨基酸序列 ,表明我们已经获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位。 结论　获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位的全长cDNA序列 ,为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础     

日本血吸虫童虫cDNA文库免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

用日本血吸虫感染14 d的小鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,将获得的7个阳性克隆进行核苷酸序列同源性分析,结果显示其中一个克隆所测序列与日本血吸虫HSP70有很高的同源性（分值score=650）,另有2个克隆所测序列分别与已报道的日本血吸虫FABP（score=229）和含锌指结构的CDGSH型蛋白样蛋白（score=246）明显同源,其余4个未找到已知的同源序列,为新基因。4个新基因序列已被GenBank接受（登录号为EU121231、202646、202647和202648）。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

目的　免疫法筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S j) 15d肝期童虫cDNA表达文库 ,并进行鉴定 ,以获得S j疫苗候选抗原分子。方法　采用紫外线照射致弱尾蚴免疫的兔血清 ,对S j中国大陆株 15d肝期童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,选取部分阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列分析 ,将结果通过Internet送入NCBIGenBank进行同源性比较 ,并将发现的新基因送入GenBank登录。结果　对大约 10 4个噬菌斑进行了初筛 ,共获得 4 9个阳性克隆 ,复筛了其中的 12个克隆 ,获得 8个持续阳性反应克隆。对 6个克隆的核苷酸序列测定及同源性分析表明 ,2个为编码S j线粒体的基因 ,另外 4个为S j未知基因 ,新基因序列已被GenBank接受 ,并获得进入编号。 结论　从S j肝期童虫cDNA文库中筛选到一批S j基因 ,其中部分为未知基因 ,为血吸虫新的疫苗候选分子的研究提供了材料。