大肠杆菌基因组水平蛋白质-RNA相互作用初步研究

目的初步研究大肠杆菌中基因组水平的蛋白质-RNA相互作用（protein-RNA interactions,PRI）。方法通过RNA酶消化细菌裂解液,提取与蛋白质相互作用的RNA片段,构建cDNA文库,进行高通量测序,并通过生物信息学分析获得与蛋白质结合的转录本。结果获得了与蛋白质结合的3193条转录本,涉及2234个mRNA、47个sRNA（small regulatory RNAs）、39个tRNA、11个rRNA以及862个基因间区（intergenic region,IGR）。结论初步获得大肠杆菌中与蛋白质相互作用的转录本信息,为进一步开展PRI研究提供了支持。     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。     

HP1γ通过与肝细胞核因子1α相互作用抑制其转录活性

目的初步探讨肝细胞核因子1α（HNF1α）与异染色质蛋白1γ（HP1γ）的相互作用及其功能。方法首先以成人肝cDNA文库为模板,通过聚合酶链反应（PCR）扩增出552 bp的HP1γcDNA片段,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-HisB,转染HepG2细胞后提取总蛋白进行Western印迹鉴定,进而通过GST沉降实验验证HP1γ与HNF1α的相互作用区段,最后通过荧光素酶报告基因实验HP1γ/HNF1α相互作用的功能。结果通过测序证实真核表达载体Myc-HP1γ构建成功,Western印迹证明Myc-HP1γ可在真核细胞中表达;GST沉降结果表明HP1γ与HNF1α的N端1-189氨基酸相互作用;报告基因实验证明HP1γ抑制HNF1α的转录活性。结论 HP1γ通过与HNF1α相互作用抑制HNF1α的转录活性。     

串联MS2衣壳蛋白和MS2特异结合RNA表达载体构建及应用

目的构建体内研究RNA-蛋白相互作用的表达载体。方法利用MS衣壳蛋白可与MS2结合位点（MS2bs）RNA特异性结合的特点,通过设计特异引物,构建pcDNA3．0-Flag．2XMS2和pcDNA3．0—12XMS2％s表达载体,以及表达MEG3非编码RNA的表达载体pcDNA3．0-EG3V1—12XMS2bs。共转染细胞,进行RNA免疫沉淀,所得RNA进行实时定量PCR分析验证。结果成功构建了pcDNA3．0-Flag-2XMS2和pcDNA3．0．12XMS2bs表达载体,实时定量PCR结果表明,与对照相比能明显富集MEG3V1非编码RNA分子。结论成功构建了体内研究RNA-蛋白质相互作用的表达载体,为RNA一蛋白相互作用研究提供了新的技术方法。     

hPeriod1PAS结构域相互作用蛋白的筛选和研究

目的寻找与近日节律系统核心基因Period1（Per1）相互作用的新蛋白，揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法，以人Per1的PAS结构域为诱饵，扫描人下丘脑cDNA文库，并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用；通过RT—PCR检测RACK1（receptors for activated Ckinase）表达的组织特异性及节律性；运用RNAi技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用；RACK1在多器官组织保守表达，但其表达未呈现明显节律性；上调及下调Per1表达，RACK1的RNA水平无显著变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白，可能介导、调控Per1的功能。     

胶原沉积抑制因子cDNA的分子克隆及其在大肠杆菌DH5α的表达

目的：获取胶原沉积抑制因子（Deeorin）互补脱氧核糖核酸（cDNA）并在大肠杆菌DH5α中表达出成熟蛋白。方法：用巢式逆转录聚合酶链反应（nest-RT-PCR）法从体外培养的成纤维细胞（2BS）中获取Deeorin cDNA，克隆入pMD18-T载体。测序后，将成熟蛋白区亚克隆入pGEX-4T-1中，用PCR法、限制性酶切和测序对融合克隆进行鉴定。经过鉴定的融合克隆在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：获取的1181bp的Decorin cDNA片段与基因bank中收录的序列相似性达99．75％：可从GST-Deeorin成熟蛋白cDNA融合克隆中扩增出和酶切出1005bp的目的片段；融合克隆有完整的开放阅读框架；融合蛋白在大肠杆菌DH5α中成功表达。结论：获取了Decorin cDNA并在大肠杆菌DH5α中表达出GST-Deeorin成熟蛋白。     

CPI-17、ILK、ZIPK与PKCα、ε在低氧大鼠血管平滑肌中的相互作用

目的本实验室前期研究发现蛋白激酶Cα（protein kinase Cα,PKCα）、蛋白激酶Cε（protein kinase Cε,PKCε）可能通过改变CPI-17（PKC-potentiated inhibitory protein for protein phosphatase 1 of 17kDa）、ILK（integrin-linked kinase）、ZIPK（zipper-interacting protein kinase）的蛋白表达和活性,来调节失血性休克后血管钙敏感性,但这些分子是否存在直接相互作用,尚不清楚。本实验观察CPI-17、ILK、ZIPK与PKCα、ε在低氧血管平滑肌细胞（vascualr smooth muscle cell,VSMC）中的相互作用。方法采用低氧培养的大鼠VSMC,运用免疫共沉淀技术,观察PKCα、ε与下游分子CPI-17、ILK、ZIPK,以及CPI-17、ILK、ZIPK之间的相互作用。结果（1）在PKCα抗体捕获的免疫沉淀中,ILK、ZIPK抗体,尤其是ILK抗体可杂交出明显蛋白条带,CPI-17抗体不能杂交出蛋白条带;（2）在PKCε抗体捕获的免疫沉淀中,ILK、ZIPK抗体均可杂交出明显蛋白条带,CPI-17抗体不能杂交出蛋白条带;（3）在CPI-17抗体捕获的免疫沉淀中,ILK、ZIPK抗体可杂交出明显蛋白条带;在ILK抗体捕获的免疫沉淀中,ZIPK抗体可杂交出明显蛋白条带。结论PKCα可直接作用于ILK,PKCε可直接作用于ILK和ZIPK,ILK、ZIPK可直接作用于CPI-17,ILK可直接作用于ZIPK。上述分子相互作用,形成网络,共同调节大鼠失血性休克后的血管钙敏感性。     

利用荧光极化技术在均相系统内建立基于Bcl-2/Bak作用模式的高通量药物筛选体系

目的：利用荧光极化原理，在液相系统内建立基于Bcl-2／Bak相互作用模式的高通量药物筛选体系。方法：在液相系统内建立Bd-2蛋白和多肽的相互作用体系，用光度计检测荧光极化值，分析荧光极化值随蛋白或多肽浓度变化而改变的趋势。结果：对应于Bak蛋白BH3结构域的5FAM标记肽（LP）可与Bcl-2蛋白相互作用，建立了二者相互作用的饱和曲线；非标记竞争性短肽（CP）和LP竞争性地与Bcl-2蛋白结合，而无关肽（NP）则不与Bcl-2相互作用；基于Bcl-2结构筛选到的小分子化合物SC对体系内LP荧光极化值的影响模式与CP相同。结论：在均相系统内初步建立了基于抑制Bcl-2活性进而促进细胞凋亡的药物高通量筛选方法，为实现药物的高通量筛选奠定了基础。     

可选择性多聚腺苷酸化的生物学功能

可选择性多聚腺苷酸化（ alternative polyadenylation , APA）是一种普遍存在于真核生物中的基因调控机制。 APA事件的发生能使一个基因产生多种mRNA转录本,从而增加转录本的复杂度。选择不同的多聚腺苷酸化位点可以使不同的转录本具有不同的编码序列,或具有不同长度的3′端非翻译区（3′untranslated region,3′UTR）。不同长度的3′UTR可引起RNA结合蛋白或微小RNA（ miRNA）的结合位点发生变化,进而影响mRNA的稳定性、定位和翻译效率。近年来,APA的研究涉及APA的形成过程、调控APA的机制以及APA对生物学过程和疾病的影响。该文对APA的上述研究进展进行了综述。     

miRNA介导的病毒-人相互作用研究进展

微小RNA（microRNA,miRNA）是一类内源性,长度约为22核苷酸的单链RNA分子,可通过5′端的种子区与靶标转录本mRNA的3′UTR配对,导致靶mRNA的降解或翻译抑制。越来越多的研究发现,miRNA在介导病毒-人相互作用过程中发挥着重要的作用,作用模式包括病毒miRNA靶向人及自身的转录本、人miRNA靶向病毒及自身的转录本、病毒的miRNA介导人miRNA调控的网络、RNA干扰（RNAi）相关和干扰素相关的宿主对病毒的抑制及反抑制。miRNA介导的病毒-人相互作用的研究对于全面理解病毒-宿主相互作用的机制、开发抗病毒的药物具有重要意义。     

肾脏基础疾病对马兜铃酸肾病临床表现及病理改变的影响

目的了解有或无肾炎病史马兜铃酸肾病（ANN）患者发病后的临床表现及肾脏病理改变特点,减少漏诊、误诊。方法11例表现为急性肾衰（ARF）的ANN患者,均为男性,年龄17～53岁。按发病前肾功能正常时有或无肾炎病史,分为有肾炎史组（n=5）和无肾炎史组（n=6）,比较两组发病时的临床表现、尿液中红细胞计数、尿蛋白定量、尿蛋白选择性、尿糖定量、尿NAG酶、尿视黄醇蛋白（RBP）及尿氨基酸定量等指标及’肾活检病理改变。结果有肾炎史组：40％表现为少尿型ARF,问时伴有大量蛋白尿（60％）、镜下血尿（40％）及高血压（40％）,尿糖定量、尿NAG酶、尿RBP及尿氦基酸都比正常明显升高,但不如无肾炎病史组升高明显;肾脏痫理改变,同时伴有不同性质和程度的肾小球病变,以及肾问质炎细胞浸润。无肾炎病史组：均为非少尿型ARF,16％有镜下血尿,无或仅少量蛋白尿,无高血压,尿糖定量、尿NAG酶、尿RBP及尿氨基酸升高更为明显;肾脏病理改变,呈现急性肾小管坏死,兀明显肾小球病变,少或无肾间质炎细胞浸润。结论同样表现为ARF的ANN患者,发病前有肾炎病史者,易误诊为单纯。肾小球疾病而漏诊马兜铃酸肾病,应强调病史、用药史及肾}舌检的作用。无肾炎病史者,肾小管功能损伤明显,但如若不进行肾小管功能相关检查,极易漏诊.     

重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的表达重组脂联素融合蛋白（adiponectin-Trx）,并测定其生物学活性。方法从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实。将目的序列（18-247氨基酸）亚克隆至pET-32（a）表达载体,重组质粒adiponectin/pET32（a）的序列经测序证实。将adiponectin/pET32（a）转化表达宿主菌OrigamiTM（DE3）,在27℃以1mmol/L IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的蛋白经组氨酸镍螯和树脂亲和纯化。以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性。结果小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被G置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代。序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达。表达产物的相对分子量（Mr）同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43000,Trx Mr为19000。在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖。结论小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同。成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性。     

特发性多发性肌炎与激素不敏感性

特发性多发性肌炎（idiopathic polymyositis,IPM）目前认为是可治性肌病,但部分病例对激素不敏感。本文阐述关于激素抵抗新认识,提高对激素不敏感性认识,激励寻找优化治疗方案。     

非编码RNA的表观遗传学调控及在肿瘤中的异常表达

非编码RNAs（ncRNAs）在体内广泛存在,它通过表观遗传方式广泛参与多种重要的调控。对其表观遗传学调控机制还有不同观点,如通过采取RNA干扰的原理进行调控,或通过脱腺苷化作用、脱帽作用等导致靶mRNA的不稳定或抑制翻译等。这些作用使ncRNAs在肿瘤细胞中多表达异常并涉及其发生与发展的整个过程。本文综述了该领域的研究进展。     

脂肪来源干细胞的多向分化性及其在组织工程中的应用

近期研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）可以从脂肪组织获得,这类细胞被称为脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）。ADSCs与骨髓来源MSC具有相似的多向分化性,并且存在容易获取、取材创伤小和细胞获得量大等优点,因此有望成为组织工程中另一种很有前景的种子细胞来源。本文介绍了ADSCs多向分化性的最新研究进展,以及在各种组织工程中的应用情况。     

原子力显微技术在膜蛋白研究中的应用

膜蛋白是一类结构独特的蛋白质,执行很多重要的细胞生物学功能。原子力显微技术（AFM）是一种高分辨率的显微成像系统,可在亚纳米分辨率水平对生物膜及膜蛋白进行成像和功能研究,利用AFM研究膜蛋白具有广阔的应用前景。本文综述了AFM在膜蛋白研究方面的应用。     

心脏专用碲化镉锌相机的相关临床应用新进展

在评估缺血性心脏病的无创性方法中,SPECT心肌灌注显像（MPI）是大家公认的显像方法,但MPI受到一些因素的影响,如组织不均一性导致的衰减、扫描时间长、辐射等。近年来出现的心脏专用碲化镉锌（CZT）相机越来越受到人们的广泛关注,该设备有先进的CZT探测器、采集方法及重建算法。心脏专用CZT相机的计数率、空间分辨率和能量分辨率较传统SPECT显著提高。该文就心脏专用CZT相机的相关临床应用进展进行综述。     

酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证

 目的 通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据。方法 将诱饵质粒pGBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体pCMV - Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull- down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用。结果 诱饵质粒pGBKT7 -LCMR1与95D细胞cDNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载pCMV-Myc-LCMR1、pcDNA3.0-flag-RPL29及pcDNA3.0- flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用。结论 酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用。