胚胎大鼠脊髓神经干细胞的培养及鉴定

为了探讨胚胎大鼠脊髓神经管神经干细胞体外培养、鉴定的方法,本实验在解剖显微镜下机械性分离11.5 d的胚胎大鼠脊髓神经管,并制备细胞悬液,无血清培养基培养。应用免疫荧光染色方法对原代和传代细胞进行巢蛋白(nestin)鉴定;加入胎牛血清诱导其分化后分别行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)鉴定。结果显示:11.5 d胚胎大鼠脊髓神经管来源的神经干细胞经连续传代培养可形成较多克隆球,呈nestin免疫阳性;加入胎牛血清可诱导其分别向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。本实验结果提示,利用E11.5的胚胎大鼠脊髓神经管可成功培养出大量稳定增殖并有多向分化潜能的神经干细胞,可用于进一步的研究。     

神经干细胞移植修复大鼠脊髓半切伤的研究

目的：观察神经干细胞移植修复脊髓半切伤的疗效并探讨移植最佳时机。方法：制备大鼠T13-L1脊髓半切伤模型，取胎龄13、5d胎鼠大脑组织，体外分离、培养、诱导神经干细胞，并采用免疫细胞化学技术分别检测NSC（neural stemcell）特征性标志Nestin（巢蛋白）表达和用血清诱导分化为大量神经元NSE（neuron specific enolas）和神经胶质细胞GFAP（glial fibrillary acidic protein）表达。用明胶海绵吸附BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）标记好的神经干细胞悬液移植到脊髓半横断处，移植时间选择损伤后立即移植、损伤后第9、14d。观察移植后的大鼠行为的变化，通过CBS（combine behavioral score）评分和爬网格实验评价大鼠的运动功能恢复情况，并进行免疫组化鉴定，光学显微镜观察移植神经干细胞的存活和迁移。结果：在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球；用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。与对照组相比，神经干细胞移植组明显修复了损伤结构，改善了下肢的功能，尤其是第9d移植组。结论：神经干细胞移植促进了脊髓损伤后神经结构和功能的恢复，是治疗脊髓半切伤一种有效方案，考虑综合因素移植干细胞的最佳时机应选损伤后9d左右。     

不同鼠龄生后大鼠海马神经干细胞的传代和分化

目的研究不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)的传代增殖和分化情况。方法将生后SD大鼠分为3d、10d、20d 3组,应用胰酶消化法将海马组织制成单细胞悬液,用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27的无血清细胞培养技术进行体外培养,单克隆培养后通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;细胞传3代后,在各组培养基中加入终浓度为10%的血清诱导分化,1周后进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例,进行统计学分析。结果3组SD大鼠海马组织细胞,单克隆培养后表达Nestin,诱导分化后分别表达NSE和GFAP。生后3d大鼠神经干细胞在传1-6代时每代均快于生后10d和20d大鼠,传6代后,3组细胞传代时间间隔几近一致;生后3d组大鼠海马神经干细胞分化为神经元的比例较其它2组高(P<0.05)。结论生后3d大鼠神经干细胞增殖速度和分化为神经元的数量都高于10d和20d大鼠。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离和培养方法,并用黄芪体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞样细胞。方法利用梯度离心从大鼠骨髓中分离单核细胞进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化,对其生长特性进行分析。采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经细胞样细胞,观察细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果用含10%胎牛血清(FCS)的培养基培养,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆团形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,有较强的增殖能力。经黄芪诱导后,骨髓间充质干细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,在一定条件下向神经样细胞分化。     

颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定

目的:研究颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定,为立体定向自体神经干细胞移植治疗脑出血、脑梗塞及颅脑损伤后遗症提供临床前基础。方法:通过改进原代培养方法,从颅脑手术患者废弃脑组织中培养和鉴定神经干细胞(NSCs)。收集颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织各约500 mg以上,按改良方法进行原代培养并传代,通过免疫荧光检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达,传代培养5代时开始进行诱导分化。结果:培养约3～10 d后,多数患者废弃脑组织中均可见干细胞球生长,经Nestin免疫荧光检测均呈阳性表达。选取第6代诱导分化后的贴壁细胞分别经β-Tubulin(神经元标志物)、Sox10(少突胶质细胞标志物)与GFAP(星形胶质细胞标志物)免疫荧光检测,可见少量神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞阳性表达。取第3代与第6代细胞行免疫印迹鉴定,第3代细胞仅见Nestin与少量β-Tubulin表达,第6代细胞可见不同程度的Nestin、β-Tubulin、Sox10及GFAP等表达。结论:本研究成功从颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织中分离培养获得成人NSCs,并可向神经元及神经胶质细胞分化,使立体定向自体神经干细胞移植促进神经功能修复从实验室到临床应用成为可能。     

己烯雌酚对体外培养胎鼠中脑NSCs增殖分化的影响

为观察己烯雌酚对体外培养的胎鼠中脑神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响,将孕14d的SD大鼠胎鼠中脑取出,制成单细胞悬液行悬浮培养,5d后行NSCs鉴定、传代及诱导分化实验。实验分空白对照组和己烯雌酚组(浓度分别为10-9、10-8、10-7mol/L)。在倒置显微镜下观察各组细胞的存活及生长状况,免疫荧光化学方法行NSCs鉴定及诱导分化后神经元特异烯醇化酶(NSE)及神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达情况的检测。结果显示:己烯雌酚浓度在10-8mol/L时中脑NSCs增殖、分化明显,并能提高神经元的分化率。由此说明己烯雌酚对中脑NSCs的增殖分化具有促进作用,并能促进其向神经元分化。     

人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化

探讨从人胚脑分离培养的神经干细胞在增殖和分化方面的生物学特点。用无血清培养技术从 4月龄人胎中脑组织中分离培养出神经干细胞 ,用有限稀释法获得单细胞克隆球 ,消化后用含 Brd U的培养液培养 ,待形成神经干细胞球后 ,进行 Brd U和nestin免疫荧光检测。取第 4代神经干细胞球用含 10 % FBS的培养液诱导分化 ,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物 MAP-2、GFAP和 CNP免疫荧光检测。结果显示 ,单细胞悬液培养 2周后可形成神经干细胞球 ;神经球 Br-d U和 nestin免疫荧光检测均呈阳性 ;神经干细胞分化后呈 MAP-2、GFAP和 CNP阳性的三种类型细胞 ,但分化的神经元数量较少、胞体较小、突起较少。提示从人胚中脑组织中分离得到的神经干细胞具有增殖和自我更新能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能 ;与啮齿类动物相比 ,人神经干细胞增殖速度较慢 ,分化的神经元较少且稍欠成熟     

大鼠乳鼠肌源性干细胞体外诱导分化为神经样细胞

目的:探讨神经生长因子(NGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠乳鼠肌源性干细胞(MDSCs)分化为神经样细胞的可行性.方法:取SD大鼠乳鼠骨骼肌,差速贴壁至第5代时培养液中加入诱导培养基培养,行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析.结果:分化后细胞NSE染色阳性,RT-PCR结果显示,诱导后MDSCs样品中检测到NSE、GFAP特异性条带.结论:在一定条件下NGF和bFGF联合诱导法可以诱导MDSCs分化为神经样细胞.     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

大鼠胚胎脑和脊髓神经干细胞分化特性比较

体外分离大鼠胚胎脑和脊髓神经干细胞,经培养传代后,撤除生长因子(bFGF和EGF)并给予 1%胎牛血清促其自然分化,然后比较两者的分化规律,以及传代次数对分化的影响。结果发现:在完全相同的培养条件下,来源于脑和脊髓的神经干细胞均可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,但两者分化为神经元的能力均随细胞体外传代次数的增加而显著下降 (P<0. 05);此外,脑来源的神经干细胞分化为神经元的能力远高于脊髓来源的神经干细胞 (P<0. 01)。提示,来自中枢神经系统不同部位的神经干细胞在分化潜力上存在差别,体外传代会影响神经干细胞的分化能力。     

成年小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及分化

目的:建立一种简便易行的从成年小鼠脑组织分离、培养和鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法,为相关研究提供新的研究手段。方法:采用机械分离和酶消化结合方法分离成年昆明种小鼠的脑组织,用无血清培养基悬浮培养;倒置相差显微镜观察细胞形态;MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)观察NSCs的自我增殖能力;免疫荧光细胞化学技术检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达;多聚赖氨酸铺板和撤除培养基中FGF和EGF的条件下,给予5%血清和1μm维甲酸诱导NSCs分化,免疫荧光细胞化学技术检测GFAP(标记胶质细胞),β-tubulin Ⅲ(标记神经元)蛋白的表达来测定NSCs的分化能力。结果:从成年小鼠脑组织分离的细胞,在无血清培养液中可形成神经球,并可在体外扩增和连续传代,免疫荧光细胞化学表明神经球Nestin阳性表达,在给予血清和维甲酸条件下神经球可表达GFAP和β-tubulin Ⅲ。结论:本研究成功建立了体外培养成年小鼠脑组织分离和培养NSCs的方法,培养的NSCs具有自我更新、增殖及多向分化潜能。此方法是一个稳定、简便易行的方法,可广泛用于神经干细胞相关的基础和应用研究。     

脑源性神经营养因子基因修饰的胚胎大鼠皮质神经干细胞及其在体外的分化

目的 探讨脑源性神经营养因子（BDNF）基因修饰大鼠脑皮质神经干细胞（NSCs）后BDNF的表达,并观察其对NSCs体外诱导分化的影响。 方法 体外分离、培养大鼠胚胎脑皮质神经干细胞并鉴定;构建BDNF基因重组质粒,非脂质体法转染NSCs,实验分为pcDNA3-1- BDNF组、pcDNA3-1组和未转染NSCs组。免疫细胞化学技术和RT-PCR检测转染后BDNF蛋白和mRNA的表达;在含5％胎牛血清的分化培养基中诱导分化,βIII微管蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP） 和突触素( SYP)免疫细胞化学染色对分化细胞进行鉴定,并观察pcDNA3-1-BDNF转染NSCs分化过程中SYP的表达变化。 结果 体外培养获得巢蛋白（nestin）阳性的NSCs。成功构建BDNF基因重组质粒,免疫细胞化学和RT-PCR检测均显示,与pcDNA3-1组和NSCs组比较,pcDNA3-1-BDNF组NSCs的BDNF表达明显增强（P<0.05）。pcDNA3-1组和NSCs组比较,无显著性差异（P＞0.05）。分化后第4天,各组细胞均可分化为Βiii-微管蛋白阳性和GFAP阳性细胞,pcDNA3-1-BDNF组可见少量SYP阳性表达细胞。分化后第7天,与pcDNA3-1组和NSCs组比较,pcDNA3-1-BDNF组NSCs分化为βIII微管蛋白阳性神经元的比例明显增高,有显著性差异（P<0.05）,SYP阳性细胞数增多,表达增强。 结论 BDNF转染NSCs具有体外分泌BDNF的能力,能够促进NSCs定向分化为神经元,SYP表达增强,可能在促进神经元之间的突触发生中发挥作用。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

The effect of topology of chitosan biomaterials on the differentiation and proliferation of neural stem cells

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into three principle central nervous system cell types under specific local microenvironments. Chitosan films (Chi-F), chitosan porous scaffolds (Chi-PS) and chitosan multimicrotubule conduits (Chi-MC) were used to investigate their effects on the differentiation and proliferation of NSCs isolated from the cortices of fetal rats. In the presence of 10% fetal bovine serum most NSCs cultured on Chi-F differentiated into astrocytes, NSCs cultured on Chi-MC showed a significant increase in neuronal differentiation, while Chi-PS somewhat promoted NSCs to differentiate into neurons. However, in serum-free medium with 20 ng ml^?1 basic fibroblast growth factor NSCs cultured on Chi-F showed the greatest proliferation, NSCs cultured on Chi-MC showed moderate cell proliferation, but NSCs cultured on Chi-PS exhibited the least cell proliferation. These observations indicate that chitosan topology can play an important role in regulating differentiation and proliferation of NSCs and raise the possibility of the utilization of chitosan in various structural biomaterials in neural tissue engineering.     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

督脉电针对移植在大鼠脊髓全横断损伤处的神经干细胞存活分化和迁移的影响

目的探讨督脉电针对脊髓全横断损伤处移植的神经干细胞存活、分化和迁移的影响。方法将20只成年SD大鼠分为神经干细胞移植14d组（NSCs14d组）、督脉电针＋神经干细胞移植14d组（电针NSCs14d组）、神经干细胞移植30d组（NSCs30d组）和督脉电针＋神经干细胞移植30d组（电针NSCs30d组）4组。所有动物均实施T10段脊髓全横断手术，其中电针组和电针NSCs组于术后5d进行电针治疗。分别于术后14d和30d取材检测移植在脊髓损伤处的神经干细胞存活、分化和迁移情况。结果1．电针NSCs14d组或电针NSCs30d组移植的神经干细胞存活数量均多于NSCs14d组或NSCs30d组，但是电针NSCs30d组或NSCs30d组移植的神经干细胞存活数量均少于电针NSCs14d组或NSCs14d组。2．电针NSCs30d组和NSCs30d组的脊髓全横断损伤处及其相邻的组织均有少量移植的神经干细胞呈现微管相关蛋白2（MAP2）阳性染色。3．电针NSCs30d组和NSCs30d组的脊髓全横断损伤处及其相邻的组织均可观察到较多移植的神经干细胞呈现胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）阳性染色。4．在电针NSCs14d组或电针NSCs30d组，移植的神经干细胞向脊髓损伤处尾端组织迁移的距离明显长于NSCs14d组或NSCs30d组。结论督脉电针能够促进大鼠脊髓全横断损伤处移植的神经干细胞存活，这些细胞能分化为MAP2或GFAP阳性细胞；督脉电针对移植在脊髓损伤处的神经干细胞向宿主脊髓组织迁移方向有一定的影响。     

成年大鼠活体嗅粘膜原代培养细胞中神经干细胞的生长特性及形态学观察

为建立成年活体嗅粘膜神经干细胞的简便、实用的体外培养方法 ,进而为神经干细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤的研究提供更为安全的候选细胞 ,本实验自成年大鼠活体分离剪取部分嗅粘膜经胰酶消化制成细胞悬液 ,接种于玻璃培养皿 ,用含 10 %胎牛血清的 F12培养基培养 ,动态观察神经干细胞克隆球的形成及分化过程 ,并用 nestin、NSE、GFAP、vim entin及laminin等抗体作免疫细胞化学染色 ,对阳性细胞进行形态学鉴定。结果显示 ,成年大鼠经嗅粘膜活体取材后 ,可长期存活。成体嗅粘膜细胞混合体外培养时不同类型细胞的贴壁时间存在差异 ,神经干细胞呈球形 ,不直接贴附于培养皿 ,仅粘着在首先贴壁的扁平基底细胞上分裂形成克隆球 ,球内细胞 nestin免疫细胞化学染色阳性。原代培养 14 d后克隆球不再生长 ,球周细胞逐渐向外迁移分化为嗅细胞和嗅鞘细胞。提示 ,成体嗅粘膜神经干细胞可在普通培养基中形成干细胞克隆球 ,嗅粘膜中的其它细胞作为神经干细胞的基底饲养细胞有助于干细胞克隆球的形成 ;活体分离成体嗅粘膜作混合细胞体外培养获取神经干细胞的方法简便、安全、可行 ;本结果为嗅粘膜神经干细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤的可行性研究提供了动物实验资料。     

Development of neural stem cells at different sites of fetus brain of different gestational age

Objective: This study aimed to investigate the development of neural stem cells (NSCs) in fetal brain, which may provide experimental evidence for the clinical treatment of brain injury in children. Methods: A total of 60 fetuses were collected after labor induction and divided into 6 groups according to the gestational age (16 w, 20 w, 24 w, 28 w, 32 w and 36 w; n=10 per group). The hippocampus, striatum, subventricular zone, frontal lobe, temporal lobe, occipital lobe and parietal lobe were harvested. In situ hybridization, immunohistochemistry and light microscopy were done to determine the morphology and quantity of NSCs. Results: NSCs were identified in the brain of fetuses with different gestational age. NSCs were round, oval, spindle-shaped, starlike, triangular or polygonal. NSC colony was also observed with symmetrical or asymmetrical division. Single NSC, group-like NSCs and cluster-like NSCs were found in the different sites of fetal brain, and NCSs interacted with each other via synapses. However, the distribution, morphology, growth and quantity of NSCs were different in the brain of fetuses with different gestational age. The number of NSCs reduced with the increase in gestational age, but they were always observed. Conclusion: The morphology of NSCs in fetal brain is variable and they are widely distributed in the hippocampus, subventricular zone, striatum and cortex. The number of NSCs reduced with the increase of gestational age.