伴放线放线杆菌产生的细胞致死膨胀毒素及其与牙周病的关系

伴放线放线杆菌能产生一种热不稳定蛋白——细胞致死膨胀毒素。该毒素主要由三个相邻的基因编码，分别为cdtA，cdtB，cdtC，对应的蛋白产物分别是CDTA，CDTB，CDTC，它们构成三聚体的全毒素。它能引起细胞体积膨胀，使细胞停滞在G2／M周期而不能进入分裂期，通过线粒体途径导致淋巴细胞凋亡，诱导细胞因子的合成和分泌。由于该毒素具有多种细胞毒性，在牙周炎的发生发展中可能具有重要的致病作用。     

伴放线放线杆菌细胞致死性膨胀毒素研究进展

伴放线放线杆菌产生一种毒性蛋白成分——细胞致死性膨胀毒素（cytolethal distending toxin,CDT）。该毒素由3个相邻基因cdtA（669 bp）、cdtB（852 bp）、cdtC（561 bp）编码的蛋白亚基CdtA（28 000 Da）、CdtB（32 000 Da）、CdtC（20 000 Da）组成异源三聚体全毒素。CDT引起细胞膨胀,导致细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,还能诱导淋巴细胞凋亡,影响宿主免疫功能,诱导细胞因子分泌等,在牙周病的发生发展过程中发挥至关重要的作用。本文就伴放线放线杆菌CDT各亚基及其致病机制作一综述。     

伴放线放线杆菌形态变化对白细胞毒素分泌影响的研究

目的观察伴放线放线杆菌形态变化对白细胞毒素分泌的影响。方法选择粗糙型和光滑型伴放线放线杆菌各8株,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测液体培养12、24、48、60、72h的菌体及培养上清液中116kDa大小白细胞毒素蛋白条带的情况,应用超滤法分离纯化培养上清液蛋白,应用台盼蓝染色排除法检测上清液蛋白白细胞毒素活性。结果粗糙型伴放线放线杆菌菌株液体培养12、24、48、60、72h菌体蛋白电泳均可见116kDa大小的蛋白条带,培养上清液蛋白电泳结果显示116kDa大小的蛋白条带均出现于培养24和48h;光滑型伴放线放线杆菌菌株液体培养12、24、48、60、72h菌体蛋白电泳结果均缺少116kDa大小的蛋白条带,培养上清液蛋白电泳结果显示116kDa大小的蛋白条带出现于培养12和24h;实验菌株培养上清液提取蛋白均具有白细胞毒素活性。结论伴放线放线杆菌粗糙型和光滑型菌株均可分泌具有直接杀灭人多形核白细胞活性的白细胞毒素,但粗糙型菌株分泌白细胞毒素的时间晚于光滑型。     

放线共生放线杆菌表面相关物质的提取和纯化

目的：提取并纯化放线共生放线杆菌表面相关物质。方法：厌氧环境下液体培养放线共生放线杆菌（Ｙ４）７２ｈ，低温超速离心分离细菌，上清液经超滤浓缩后，以６０％硫酸铵粗提，ＨＰＬＣ纯化，检测各峰细胞毒性以及蛋白质含量、总糖含量、内毒素含量，透射电镜观察。结果：透射电镜显示：液体培养７２ｈ多数细菌表面电子阻射区剥离；粗提物经ＨＰＬＣ显示一个蛋白主峰中含３个小蛋白峰，峰Ⅱ有细胞毒性，此峰为糖蛋白，内毒素含量极微。结论：提取、纯化毒素的主要毒力成份是细菌表面相关物质     

伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素的细胞毒性研究

目的:体外诱导表达伴放线放线杆菌(Aqqregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)细胞致死性扩张毒素(cytolethal distending toxin,CDT),观察其对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)和人宫颈癌上皮细胞(HeLa cell)的毒性作用。方法:诱导重组蛋白Aa CdtA、CdtB、CdtC的体外表达,采用镍亲和层析柱法纯化目的蛋白,体外重构Aa CDT全毒素。通过体外酶活性实验检测重组蛋白CdtB的生物学活性,并通过细胞克隆形成实验(Colony-forming experiment)及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe nyltetrazolium bromide,MTT]比色法进一步观察CDT对CHO细胞和HeLa细胞的毒性作用。结果:由重组蛋白Aa CdtA、CdtB、CdtC体外重构获得的Aa CDT全毒素不仅抑制CHO细胞增殖,导致CHO细胞克隆形成单位(Colony-Forming Unit,CFU)数目减少甚至消失。也可抑制He-La细胞增殖并引起包括细胞体积增大及细胞核增大增多的细胞形态学改变,并且此增殖抑制作用呈浓度依赖性。结论:体外成功构建了具有生物学活性的Aa CDT全毒素,且Aa CDT毒性发挥需要三个亚基CdtA、CdtB、CdtC同时存在并构成三聚体。     

伴放线放线杆菌高毒株与局限性青少年牙周炎相关性研究进展

伴放线放线杆菌与局限性青少年牙周炎的关系密切。该菌的多种毒力因子中，白细胞毒素的研究最深入。菌株编码白细胞毒素的操纵子中启动子区的结构存在差异，从而影响产生白细胞毒素的量，形成致病力强的高毒株，并与不同人群中局限性青少年牙周炎的发病情况相关。本文就伴放线放线杆菌与局限性青少年牙周为的相关性进行综述。     

伴放线放线杆菌高毒株与局限性青少年牙周炎相关性研究进展

伴放线放线杆菌与局限性青少年牙周炎的关系密切。该菌的多种毒力因子中,白细胞毒素的研究最深入。菌株编码白细胞毒素的操纵子中启动子区的结构存在差异,从而影响产生白细胞毒素的量,形成致病力强的高毒株,并与不同人群中局限性青少年牙周炎的发病情况相关。本文就伴放线放线杆菌与局限性青少年牙周炎的相关性进行综述。     

伴放线放线杆菌外膜蛋白的研究进展

伴放线放线杆菌与牙周炎,特别是与局限性侵袭性牙周炎有着密切的关系.伴放线放线杆菌外膜蛋白作为其重要毒力因子,在牙周病的发病中起着重要的作用.本文就近年来有关伴放线放线杆菌外膜蛋白的结构特征、外膜蛋白的表现型、外膜蛋白与血清型、外膜蛋白的致病性等研究进展作一综述.     

伴放线放线杆菌磷酸胆碱的电泳分析

目的 比较3个磷酸胆碱阳性的伴放线放线杆菌菌株在蛋白酶K作用后电泳结果的变化,分析磷酸胆碱抗原在细菌中的附着结构.方法 将培养收集的伴放线放线杆菌破碎处理后,加入蛋白酶K水解,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),考玛斯亮蓝染色显示蛋白条带的分布情况,免疫印迹法检测磷酸胆碱的分布情况.结果 伴放线放线杆菌的3个菌株SA716、SA1398、SA2791通过SDS-PAGE电泳,可见未经蛋白酶K处理的细菌悬液显示连续分布的蛋白条带,而蛋白酶K处理后,只显示1条蛋白条带,该条带在只有等量蛋白酶K的对照组也出现,而在未经蛋白酶K处理的细菌悬液中无该条带,可以确定这一条带是蛋白酶K,细菌蛋白都已经被分解.未经蛋白酶K处理的菌株通过SDS-PAGE电泳和磷酸胆碱免疫印迹检测,磷酸胆碱显示阳性结果,磷酸胆碱附着结构分子量大小约为9 kDa,而蛋白酶K处理后,显示阴性结果,磷酸胆碱信号消失.结论 伴放线放线杆菌磷酸胆碱信号在蛋白酶K处理后消失,提示该抗原的附着结构为蛋白成分.     

伴放线放线杆菌与牙周病相关细胞凋亡关系的研究

牙周病是口腔的常见病和多发病，但其具体机制至今尚未完全明了。大量研究证实，细胞凋亡在牙周病的发生和发展过程中起重要作用。伴放线放线杆菌是牙周炎主要致病菌之一，可产生多种毒力因子。本文就伴放线放线杆菌的各种毒力因子与细胞凋亡及伴放线放线杆菌与牙周组织内多种细胞凋亡的关系进行综述。     

伴放线放线杆菌菌毛研究进展

伴放线放线杆菌是侵袭性牙周炎的可疑致病菌,菌毛是其重要的致病因子。本文对伴放线放线杆菌菌毛的形态、相关基因和蛋白、基因表达的相关调控、致病作用以及免疫原性进行了综述。     

伴放线放线杆菌菌毛研究进展

伴放线放线杆菌是侵袭性牙周炎的可疑致病菌，菌毛是其重要的致病因子。本文对伴放线放线杆菌菌毛的形态、相关基因和蛋白、基因表达的相关调控、致病作用以及免疫原性进行了综述。     

伴放线放线杆菌光滑株与粗糙株生长及磷酸胆碱表达的比较研究

目的 绘制伴放线放线杆菌同一菌株不同表型的生长曲线,测定菌体蛋白表达上的差异。方法 采用液体培养基TSB培养伴放线放线杆菌分离株D7S及其光滑型菌株D7SS,紫外分光光度计检测细菌密度,连续观测30h,绘制生长曲线。聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后考马斯亮蓝染色比较两种表型的细菌蛋白的差异。免疫印迹法(Western Blot)观察两种表型细菌蛋白对单克隆抗体TEPC-15的反应情况。结果 D7SS菌株比D7S菌株更早进入对数期和衰亡期;两型细菌全细胞蛋白电泳考马斯亮蓝染色时蛋白带未见明显差异;免疫印迹分析D7S菌株在分子质量接近10ku的蛋白中存在磷酸胆碱,而D7SS中未发现。结论 伴放线放线杆菌D7S和其光滑型菌株D7SS的生长曲线以及对TEPC-15抗体的反应性明显不同。     

伴放线放线杆菌cdtB基因克隆及其表达蛋白的体外生物学活性检测

目的 体外构建伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)CdtB蛋白的原核表达载体并诱导其表达,通过变性、复性获得有Ⅰ型脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease Ⅰ,DNase Ⅰ)样活性的重组CdtB蛋白,为进一步研究AaCdtB的功能以及Aa细胞致死性扩张毒素三聚体全毒素在牙周炎发生、发展过程中的分子致病机制奠定基础.方法 以AaATCC29522基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)法获得cdtB基因,经双酶切、连接的定向克隆技术构建原核表达载体pET-15b-cdtB.转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导CdtB蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及蛋白质印迹法检测并鉴定蛋白表达.纯化的重组CdtB体外与超螺旋质粒(pET-32a)DNA孵育,观察其生物学活性.结果 经测序鉴定,构建的原核表达载体pET-15b-cdtB转染的感受态大肠杆菌携带有cdtB基因,该基因片段与GenBank中已收录的AacdtB基因序列一致性高达99%.SDS-PAGE观察到32 000左右的高表达蛋白条带,蛋白质印迹法发现带有6个组氨酸蛋白标签标记的目的 蛋白CdtB.超螺旋质粒DNA与CdtB体外孵育后发生了解螺旋现象.结论 本项研究成功构建了AaCdtB的原核表达载体并诱导CdtB蛋白的体外表达,获得了具有DNaseⅠ样活性的重组CdtB蛋白.     

伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因的克隆

目的　探讨克隆伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因ltb-fap的方法。方法　采用PCR方法扩增伴放线放线杆菌菌毛相关蛋白(Fap)和大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(Ltb)的融合蛋白基因ltb-fap,NcoⅠ/EcoRⅠ双酶切载体pET28a(+)及ltb-fap基因,连接形成重组质粒pETltb-fap,转化至大肠杆菌DH5α,扩增后提取质粒pETltb-fap进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果　本实验扩增的ltb基因约为303 bp,fap基因约为228 bp,融合基因约为 531 bp。重组质粒含外源基因片段约为531 bp,酶切鉴定可得到一条约531 bp带,DNA测序结果表明与GenBank中的fap基因序列有97·4%的同源性。结论　成功克隆出融合蛋白基因ltb-fap,为进一步进行蛋白表达、制备抗体奠定基础。     

伴放线放线杆菌诱导人外周血淋巴细胞活化及凋亡的体外研究

目的研究伴放线放线杆菌诱导人外周血淋巴细胞活化及凋亡的作用。方法选取10名全身及牙周组织健康受试者,分离外周血淋巴细胞,在有／无伴放线放线杆菌情况下培养0—96h,用荧光探针（AnnexinV—FITC、PI、CD69-TC7）进行标记,并进行流式细胞仪检测。结果全淋巴细胞加伴放线放线杆菌组AnnexinV＋／PI-细胞百分数在48h、72h、96h分别为13．42±2．88、22．74±2．18、46．92±4．28,全淋巴细胞组AnnexinV＋／PI-细胞百分数在48h、72h、96h分别为8．46±2．53、6．36±2．36、9．36±2．67,2组间存在明显差异（P〈0．01）。CD69加淋巴细胞加伴放线放线杆菌组和CD69＋淋巴细胞组AnnexinV＋／PI-细胞百分数除48h外的4个时间点上都无明显差异（P〉0．05）。CD69＋淋巴细胞加伴放线放线杆菌组AnnexinV＋／PI-细胞百分数在各个时间点上都明显高于全淋巴细胞加伴放线放线杆菌组（P〈0．01）。结论伴放线放线杆菌能够诱导人外周血淋巴细胞活化,并且能够通过活化促进其凋亡。     

放线共生放线杆菌表面相关物质对人牙龈成纤维细胞的增殖抑制作用

目的：观察放线共生放线杆菌表面相关物质对人牙龈成纤维细胞的增殖抑制作用。方法：采用细胞计数法和图像分析法观察对人牙龈成纤维细胞的生长抑制作用。结果：此物质抑制作用明显，能抑制细胞的分裂、增殖，使细胞、细胞核面积增大，１００ｍｇ／Ｌ对与对照组差别显著（Ｐ＜０．０５），且细胞无死亡现象。结论：此物质可明显抑制人牙龈成纤维细胞的生长、增殖，在牙周病病理变化过程中起重要作用     

放线共生放线杆菌的分离鉴定及其与牙周炎关系的探讨

经选择分离培养,从14例青少年牙周炎(JP)患者和35例成人牙周炎(AP)患者的牙周袋中鉴定出放线共生放线杆菌(A.a)14株,其中12株为白细胞毒素株。结果表明:A.a 的感染与IP 和 AP 的发生有一定的关系,其白细胞毒株与临床关系尤为密切。     

伴放线聚集杆菌细胞致死性膨胀毒素介导人T淋巴细胞凋亡的实验研究

目的 通过研究伴放线聚集杆菌(aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)的一种毒力因子细胞致死性膨胀毒素（cytolethal distending toxin,CDT）诱导人T淋巴细胞发生凋亡过程中表达改变的相关基因,探索其凋亡过程中可能存在的相关信号调节通路,寻找侵袭性牙周炎诊断、治疗潜在的生物标记分子。方法 通过透射电镜和流式细胞仪检测细胞凋亡的情况,荧光定量PCR检测CDT蛋白作用于人T淋巴细胞后凋亡相关基因表达的改变。结果 CDT蛋白作用于人T淋巴细胞24 h后,处理组细胞凋亡比例约为29.1%,对照组约为6.3%,透射电镜观察到典型的凋亡细胞的形态,如细胞体积缩小、染色质浓缩及边集等现象。荧光定量PCR结果显示促凋亡基因GADD45A、TNFSF8、TRADD、TNFRSF10B和TP53表达升高。结论 伴放线聚集杆菌CDT可以促进人T淋巴细胞的凋亡,在这一过程中相关的促凋亡基因表达增加。     

放线共生放线杆菌白细胞毒素的结构和功能

白细胞毒素是放线共生放线杆菌的一个重要毒性因子,已揭示白细胞毒素的基因包括C,A,B,D4个基因的操纵子。A为结构基因(故放线共生放线杆菌的白细胞毒素简称Ltx A),两侧的C,B,D是白细胞毒素的激活和转送所需的基因。Ltx A还表现出独特的细胞