阻断丝裂原活化蛋白激酶信号通路对卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 :研究丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/ERK)通路抑制剂PD98059对卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞增殖及侵袭能力的影响,初步探讨阻断MAPK/ERK信号转导通路以治疗卵巢癌的可能性。方法:体外培养人上皮性卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞,然后用不同浓度的PD98059处理细胞不同时间。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测2种细胞的增殖活性。蛋白质印迹法检测PD98059对2种细胞中磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)蛋白表达的影响。Transwell小室法检测PD98059作用后SKOV3和OVCAR3细胞侵袭能力的变化。结果:PD98059在一定浓度范围内能够明显抑制卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3的增殖,其作用具有时间及浓度依赖性(P值均<0.05)。PD98059能够抑制ERK1/2的磷酸化,即下调p-ERK1/2蛋白的表达(P<0.05),从而使得ERK1/2信号转导途径失活。同时,PD98059在一定浓度范围内能抑制2种卵巢癌细胞的侵袭能力(P值均<0.05)。结论:PD98059可能通过阻断ERK1/2信号通路,抑制人上皮性卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞的增殖和侵袭能力。     

MEK抑制剂增加乳腺癌细胞MCF-7对表柔比星的敏感性

背景与目的: 化疗是目前乳腺癌治疗的重要手段之一,通过抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤功效.有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号传导通路作鼢用于核内转录因子,与细胞增殖和凋亡关系密切.因此MAPK信号传导通路在化疗中所起的作用日益受到人们的重视,期望抑制此通路能改善化疗药物的疗效,从而低毒高效的治疗肿瘤.本研究通过检测表柔比星与MEK抑制剂PD98059对人乳腺癌细胞细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)活性的影响(MEK、ERK分别是MAPK{~号传导通路中的环节),探讨MEK抑制剂PD98059在表柔比星抗人乳腺癌细胞中的作用.方法: 应用表柔比星与MEK抑制剂(PD98059)处理MCF-7及MCF-7/ADR细胞,应用Western印迹法检测MEK2和p-ERK表达情况,应用MTT法检测细胞增殖状态.结果: 表柔比星处理细胞后,MCF-7的ERK蛋白活性上升,加用MEK抑制剂PD98059,细胞对表柔比星的敏感性增加.结论: MAPK信号传导通路在表柔比星杀伤敏感细胞的过程中被激活,联合应用MAPK信号传导通路抑制剂可以增加表柔比星敏感性.     

siRNA干扰ERK1/2表达对食管癌细胞 ezrin 基因的转录调控作用

 目的：检测siRNA干扰细胞外信号调节激酶ERK1/2基因表达对 ezrin 基因的转录调控作用,探讨食管癌细胞 ezrin 基因的表达调控机制。 方法：采用定量RT-PCR技术,检测转染ERK1/2 siRNA对食管癌EC109细胞ERK1/2和 ezrin 基因 mRNA表达水平的影响;采用双荧光素酶报告基因分析系统,检测siRNA干扰ERK1/2表达对EC109 细胞 ezrin 基因启动子活性的影响。 结果：在食管癌EC109细胞中,转染ERK1/2 siRNA,降低ERK1/2和 ezrin 基因的mRNA表达水平以及 ezrin 基因启动子活性。 结论：ERK1/2对食管癌细胞 ezrin 基因的转录具有调控作用。     

细胞外信号调节激酶1/2参与三氧化二砷诱导的胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路在三氧化二砷诱导的胶质瘤细胞U251凋亡中的作用,为应用三氧化二砷治疗胶质瘤奠定基础。方法:50μmol/L三氧化二砷作用U251细胞,不同时间检测胶质瘤细胞增殖活性,半定量PCR检测ERK1/2mRNA表达,Western blot检测ERK1/2蛋白表达;Ho-echst33258染色及流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡;转染ERK1/2上游激酶MEK1,应用ERK1/2激酶抑制剂U0126观察ERK1/2通路在肿瘤凋亡及增殖中的作用;比色分析法检测Caspase-3活性的变化。结果:三氧化二砷诱导胶质瘤细胞发生明显凋亡,抑制肿瘤细胞增殖;增加ERK1/2蛋白的表达,呈时间依赖性;阻断ERK1/2信号通路后胶质瘤细胞凋亡受到抑制,Caspase-3活性下降。结论:ERK1/2信号通路在三氧化二砷诱导的胶质瘤细胞凋亡中起重要作用。     

ERK信号转导通路在CXCL12促进子宫内膜癌细胞增殖和侵袭中的作用

目的:探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR4 (CXCL12/CXCR4)生物学轴通过细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号转导通路发挥促子宫内膜癌细胞增殖和侵袭的作用.方法:应用外源性CXCL12处理子宫内膜癌Ishikawa细胞株,通过Western blotting检测不同时间位点ERK1/2的磷酸化水平和Survivin蛋白的表达;通过ELISA检测细胞培养上清液中MMP-2的分泌水平.同时分析AMD3100和PD98059对细胞ERK1/2磷酸化水平、Survivin蛋白水平和MMP-2分泌水平的影响.结果:外源性CXCL12刺激后,可迅速上调ERK1/2的磷酸化水平(t=0.887,P＜0.01),促进Survivin蛋白和MMP-2蛋白的表达(t=0.861,P＜0.01;t=0.297,P＜0.01),且三者均呈时间依赖性.PD98059和AMD3100均能明显抑制外源性CXCL12诱导后ERK1/2的磷酸化水平,而且在两者共同作用下,能完全抑制ERK1/2的磷酸化水平,阻断ERK通路的激活,下调Survivin蛋白和MMP-2蛋白的表达.结论:CXCL12/CXCR4生物学轴通过激活ERK通路上调Survivin蛋白和MMP-2蛋白表达,从而引发Ishikawa细胞一系列增殖和侵袭的生物学效应.     

RNA干扰沉默Sp1基因抑制大肠癌SW620细胞的恶性增生

目的采用RNA干扰技术沉默大肠癌SW620细胞转录因子特化蛋白1（Sp1）的表达,观察其对细胞增生的影响。方法构建靶向人Sp1基因的干扰载体（pGenesil-1-Sp1）,脂质体介导转染SW620细胞,荧光倒置显微镜下观察转染效率,应用实时荧光定量PCR和Western blotting检测其对Sp1 mRNA及蛋白质水平的影响,MTT法检测SW620细胞增生活性的改变。结果成功构建针对Sp1的干扰载体,转染后能够有效抑制大肠癌SW620细胞中Sp1 mRNA和蛋白的表达,且在转染48h抑制作用最强,其对Sp1 mRNA和蛋白质抑制率分别为68．47％和73．82％,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。MTT实验显示,下调Sp1表达可显著抑制大肠癌SW620细胞的体外增生能力。结论Sp1基因沉默能够抑制人大肠癌SW620细胞的增生,为以Sp1为靶点的大肠癌基因治疗提供新的思路和手段。     

VEGF和Smac/DIABLO对胶质瘤细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的:旨在研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和第二线粒体衍生的caspase激活剂(second mitochondrial activator of caspase,Smac)/低等电点凋亡抑制蛋白直接结合蛋白(direct IAP binding protein with low PI,DIABLO)在胶质瘤发生和发展中的作用。方法:采用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默VEGF基因在胶质瘤细胞U251中的表达;分别采用实时荧光定量PCR(real-time?uorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)和蛋白质印迹法检测VEGF和Smac/DIABLO mRNA及蛋白在U251细胞中的表达水平;采用蛋白质印迹法检测磷酸化细胞外蛋白调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)的表达;FCM检测VEGF沉默对细胞周期的影响;MTT法检测VEGF沉默对U251细胞化疗敏感性的影响。结果:VEGF基因沉默可导致VEGF和Smac/DIABLO mRNA及蛋白表达水平的下调,并抑制磷酸化ERK的表达,提示VEGF是Smac/DIABLO的上游调节因子,通过激活ERK的信号通路调节Smac/DIABLO的表达水平。VEGF基因沉默导致U251细胞中处于S期的细胞比例增多,并增强顺铂对U251细胞的凋亡诱导作用。结论:VEGF可影响胶质瘤细胞周期的分布以及对顺铂的化疗敏感性。Smac/DIABLO参与了VEGF信号通路。     

食管癌细胞ezrin基因启动子TPA反应性的研究

背景与目的:研究食管癌细胞eznn基因启动子的TPA反应性以及TPA诱导ezrin基因转录的MAPK信号转导途径. 材料与方法:应用转录因子数据库分析预测ezrin基因-87/+134序列的潜在转录因子结合位点和TPA反应元件;采用双荧光素酶报告基因分析系统,检测ezrin基因-87/+134序列的启动子活性和TPA反应性,TPA反应元件结合蛋白Spl和AP-1对ezrin基因的转录激活作用,以及MAPK抑制剂对TPA诱导激活的ezrin基因转录的抑制作用.结果:ezrin基因-87/+134序列存在潜在TPA反应元件,具有启动子活性;5 ng/ml 11PA显著增强ezrin/n基因启动子活性[P<0.01);Sp1和AP-1对ezrin基因具有转录激活作用;MEK1/2特异性抑制剂U0126和PD98059降低TPA诱导的ezrin基因转录激活作用. 结论:食管癌细胞中,ezrin基因启动子具有TPA反应性;TPA可能通过MEK/ERK1/2磷酸化Sp1/AP-1途径调控ezrin基因转录.     

阿克替苷通过调控ERK1/2信号通路抑制肝癌细胞上皮间质转化

目的探讨阿克替苷(ACT)通过调控ERK1/2通路抑制人肝癌HCCLM3细胞上皮间质转化(EMT)的作用及其机制。方法CCK-8法检测肝癌细胞的增殖能力;划痕实验和Transwell实验检测肝癌细胞侵袭及迁移能力;实时定量PCR和蛋白质印迹实验检测ACT对ERK1/2信号通路和上皮间质转化相关基因(E-cadherin、N-cadherin)mRNA和蛋白的表达。结果CCK-8法检测结果显示,ACT可降低肝癌HCCLM3细胞的活性,抑制肝癌细胞的增殖能力,并与药物浓度和时间有一定的相关性。划痕实验和Transwell实验结果显示,ACT能抑制肝癌HCCLM3细胞迁移和侵袭能力,并呈浓度依赖性。荧光定量PCR和蛋白质印迹实验表明,ACT可下调ERK1/2信号通路相关基因mRNA和蛋白的表达,上调EMT相关基因E-cadherin mRNA和蛋白的表达,下调N-cadherin mRNA和蛋白的表达。结论ACT可抑制人肝癌HCCLM3细胞EMT、侵袭及迁移,其作用机制与下调ERK1/2信号通路密切相关。     

PD98059抑制MAPK/ERK信号通路对胃癌细胞生物学功能的影响

目的：研究MAPK/ERK信号通路中关键信号分子MEK和ERK在胃癌SGC-7901细胞中的表达及PD98059抑制MAPK/ERK通路对胃癌细胞生物学功能的影响。方法：体外培养胃癌细胞株SGC-7901,不同浓度（0、25、50、100、200、300和400 mmol/L）PD98059处理24 h后CCK-8法检测细胞增殖率变化;再用0、25、50和100 μmol/L PD98059处理24 h后采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测MEK和ERK mRNA的表达量;Western blot检测MEK和ERK蛋白的表达;流式细胞术检测细胞周期和凋亡变化。同时设正常胃黏膜上皮GES-1细胞为对照。结果：与正常胃黏膜上皮GES-1细胞相比,胃癌SGC-7901细胞中MEK和ERK mRNA的表达升高,差异具有统计学意义（P < 0.05）;p-MEK、p-ERK蛋白的表达亦显著升高,差异具有统计学意义（P < 0.05）。0~200 μmol/L PD98059处理SGC-7901细胞后,细胞增殖率随着抑制剂浓度的升高而降低（P < 0.05）。当PD98059浓度处于200~400 μmol/L时抑制作用逐渐趋于平稳。0~100 μmol/L PD98059作用后MEK、ERK mRNA的表达量低于对照组（P < 0.05）,随着PD98059浓度升高,ERK mRNA表达量逐渐降低（P < 0.05）。Western blot检测结果显示50和100 μmol/L PD98059作用后p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达降低（P < 0.05）。且抑制剂PD98059使胃癌SGC-7901细胞发生G0/G1期阻滞,可诱导细胞凋亡。结论：MAPK/ERK信号通路在胃癌细胞中激活,PD98059通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性可影响胃癌细胞的生物学功能。     

抑制Src酪氨酸激酶对非小细胞肺癌细胞外信号调节激酶影响的研究

目的:探讨抑制Src酪氨酸激酶活化对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞外信号调节激酶的影响及其作用。方法:采用NSCLC细胞株进行细胞培养,分别给予不同浓度的Src酪氨酸激酶抑制剂。蛋白质印迹检测NSCLC细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化以及抑制Src酪氨酸激酶活化对NSCLC细胞ERK1/2磷酸化的影响。MTT法检测抑制Src酪氨酸激酶活化对NSCLC细胞体外增殖的影响。软琼脂糖集落形成实验检测抑制Src酪氨酸激酶对NSCLC细胞克隆形成的影响。结果:选用的NSCLC细胞都存在ERK1/2磷酸化。抑制Src酪氨酸激酶对PC-9和A549细胞ERK1/2磷酸化呈现浓度依赖性抑制作用,亚微摩尔水平Src酪氨酸激酶抑制剂几乎完全抑制PC-9和A549细胞ERK1/2磷酸化。Src酪氨酸激酶抑制剂对PC-9和A549细胞体外增殖表现出明显的浓度依赖性抑制作用(F=5.072,P=0.004;F=4.368,P=0.008)。0.1、0.3和1.0μmol/L的Src酪氨酸激酶抑制剂对PC-9和A549细胞增殖的抑制率分别为14.7%、47.1%、61.3%和19.8%、24.2%、30.6%。而其余3种NSCLC细胞ERK1/2磷酸化以及体外增殖对Src酪氨酸激酶抑制剂反应不敏感。Src酪氨酸激酶抑制剂明显抑制PC-9和A549细胞的克隆形成(t=11.746,P<0.001;t=5.237,P<0.001)。结论:抑制Src酪氨酸激酶能够抑制PC-9和A549细胞ERK1/2磷酸化,从而抑制PC-9和A549细胞体外增殖。     

西仑吉肽对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用及其机制

目的 观察西仑吉肽对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用和机制,探讨其与顺铂联合应用的疗效。方法 以肺腺癌A549细胞株接种BALB/c-nu雄性裸鼠,建立动物模型。随机将裸鼠分为6组：对照组、顺铂组、小剂量西仑吉肽组、大剂量西仑吉肽组、小剂量西仑吉肽+顺铂组、大剂量西仑吉肽+顺铂组,观察肿瘤生长情况。采用免疫印迹法检测整合素β3、β5的表达,采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot 检测骨桥蛋白（OPN） 、磷酸化细胞外调节激酶1（p-ERK1）、血管内皮生长因子（VEGF） mRNA和蛋白表达水平的变化。以西仑吉肽、VEGF受体激动剂bFGF、血管内皮生长因子受体抑制剂SU5416、ERK1受体激动剂EGF和ERK抑制剂PD98095干预细胞后观察ERK1蛋白磷酸化水平、VEGF蛋白的变化。结果 与对照组比较,西仑吉肽组OPNmRNA 和蛋白表达无显著性改变,而p-ERK1和VEGF mRNA和蛋白表达均明显降低,且与单纯顺铂组比较,西仑吉肽+顺铂组肿瘤生长、ERK1和VEGF mRNA、蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义。结论 西仑吉肽对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤具有一定的抑瘤作用,并能增强顺铂抑瘤效果,其作用机制与西仑吉肽抑制ERK1活化作用和VEGF 生成有关。     

Des-γ-carboxyl prothrombin induces matrix metalloproteinase activity in hepatocellular carcinoma cells by involving the ERK1/2 MAPK signalling pathway

Des-γ-carboxy prothrombin (DCP), an aberrant prothrombin produced by hepatocellular carcinoma (HCC) cells, has been shown to be associated with the biological malignant potential of HCC. The aim of this study was to evaluate the effect of DCP on HCC cell growth and metastasis, and to explore the underlying molecular mechanisms. DCP significantly stimulated HCC cell growth, as measured by cell counting kit-8 assay. Transwell chamber assay showed that DCP increased HCC cell migration through reconstituted extracellular matrix (Matrigel). Gelatin zymography assay and Western blot analysis demonstrated that DCP increased the secretion and expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in the supernatant of cultured HCC cells and on tumour cell membranes. DCP was found to bind to the cell surface receptor Met, resulting in Met phosphorylation and subsequent activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). Western blot analysis demonstrated that DCP stimulated a sequential kinase phosphorylation cascade including ERK1/2, MEK1/2 and c-Raf, indicating activation of the extracellular signal-regulated kinase/mitogen activated protein kinase (ERK1/2 MAPK) signalling pathway. Furthermore, blocking ERK1/2 MAPK activation with ERK1/2 inhibitor PD98059 essentially abolished the DCP-induced MMP-2 and MMP-9 activity, confirming the signalling pathway of DCP stimulation. Taken together, these results suggested that DCP stimulates HCC growth and promotes HCC metastasis by increasing the activity of MMP-2 and MMP-9 through activation of the ERK1/2 MAPK signalling pathway.     

细胞外信号调节激酶1/2在瘦素促进子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖中的作用

背景与目的:流行病学研究提示瘦素与子宫内膜癌的发生有关,但其作用机制尚不清楚.瘦素作为促有丝分裂原,能够显著促进多种细胞的生长增殖.本研究的目的在于探讨细胞外信号调节激酶1/2(extraeellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)在瘦素促进子宫内膜癌细胞增殖中的作用.方法:免疫荧光染色检测Ishikawa细胞中瘦素受体的表达;于Ishikawa细胞中分别加入不同浓度的瘦素(0、10、50、100、150 ng/ml),作用不同时间(6、12、24h),MIT法检测各组细胞的增殖情况:同时应用ERK1/2激酶特异性抑制剂PD98059阻断ERK1/2磷酸化,观察其对瘦素促进Ishikawa细胞增殖的影响;应用免疫印迹技术检测100 ng/ml瘦素作用于Ishikawa细胞不同时间后(20、40、60 min)ERK1/2的活化水平(以P-ERK1/2与ERK1/2的比值表示).结果:免疫荧光检测结果证实Ishikawa细胞存在瘦素受体的表达:瘦素能明显促进Ishikawa细胞的增殖.在0～100 ng/ml范围内瘦素浓度越高.细胞增殖越显著,100 ng/ml瘦素作用24h其增殖效应最大(A值=0.73±0.02),100 ng/ml组与150 ng/ml组差异无统计学意义(P=0.129);PD98059能明显抑制瘦素对Ishikawa细胞的增殖作用.100 ng/ml瘦素和100μmol/L PD98059作用24h后,细胞增殖率为(6.88±0.86)%;Ishikawa细胞经100 ng/ml瘦素处理后,ERK1/2活化程度明显增高.结论:瘦素可能通过激活ERK1/2信号转导途径促进子宫内膜癌细胞的增殖.