乳腺癌MCF-7肿瘤细胞SP亚群初步分析

目的鉴定乳腺癌干细胞系MCF-7中是否包含肿瘤干细胞相关的SP(side population)亚群.方法制备MCF-7细胞悬液,经Hoechst33342和PI染色(其中一组同时加入拮抗剂维拉帕米作为对照),流式细胞仪分析SP亚群.另取贴壁生长的MCF-7细胞,用Hoechst33342和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)原位染色,荧光显微镜下观察细胞染色情况.结果SP亚群占MCF-7细胞的4%,维拉帕米阻断后减少为0.5%.荧光显微镜下见Hoechst33342阳性细胞约占95%.结论人乳腺癌细胞系MCF-7中存在SP亚群,即提示乳腺癌干细胞的存在;维拉帕米可抑制染料外排而减少SP细胞的比例.     

骨转移瘤中侧群细胞的初步分析

目的研究骨转移瘤原代细胞中是否存在干细胞样侧群细胞(SP细胞)。方法对乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌及宫颈癌骨转移瘤原代细胞进行Hoechst33342染色,应用荧光显微镜直接进行观察,检测骨转移瘤原代细胞中是否存在SP细胞及非SP细胞,并给予维拉帕米拮抗剂,观察各骨转移瘤瘤细胞中SP细胞亚群染色变化情况。结果所检测的乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌及宫颈癌骨转移瘤原代细胞中均存在SP细胞。荧光显微镜下,SP细胞体积较非SP细胞小,SP细胞胞核蓝色荧光呈淡染或消失;非SP细胞经染色后发出较强的蓝色荧光。给予维拉帕米拮抗剂后,各骨转移瘤细胞中胞核发蓝色荧光的细胞数目明显增多。结论乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌及宫颈癌骨转移瘤原代细胞中存在干细胞样的SP细胞。     

乳腺癌与MCF-7乳腺癌细胞株中SP含量的比较

目的鉴定乳腺癌组织、癌旁组织、正常组织与MCF-7细胞系中SP（side population）亚群含量是否有差异．方法制备乳腺癌组织、癌旁组织、正常组织细胞悬液和MCF-7细胞悬液,一组加入Hoechst33342染色,另一组同时加入拮抗剂维拉帕米,通过流式细胞仪测定sP亚群含量．结果SP亚群在癌组织、癌旁组织、正常组织和MCF-7细胞的含量分别为（0．54±0．17）％、（7．23±1．12）％、（8．34±0．96）％和（9．58±1．27）％,且它们之间的SP亚群含量具有差异显著性．结论人乳腺癌组织、癌旁组织、正常组织与MCF-7细胞系中都存在SP亚群且含量不同,能够为肿瘤干细胞的鉴定和提纯提供一定的科学参考价值．     

胃癌BGC-823肿瘤细胞系SP表型初步分析

目的〓〖HTK〗观察人胃癌BGC-823肿瘤细胞系中是否含有SP细胞及SP细胞的形态特点，并验证该表型细胞与干细胞标志物(ABCG2)的关系。〖HTW〗方法〓〖HTK〗取贴壁生长的BGC-823细胞，经Hoechst33342染色，于荧光显微镜下观察细胞染色情况，并观察拒染或浅染的SP细胞的形态特点，计算其百分比；之后对细胞爬片进行Hoechst33342染色和ABCG2的免疫荧光染色，于荧光显微镜下观察Hoechst33342染色强度和ABCG2的表达情况。〖HTW〗结果〓〖HTK〗荧光显微镜下可见BGC-823细胞系中存在SP细胞，且该类细胞体积较小，约占细胞总数的1.8%；免疫荧光染色可见爬片细胞中ABCG2+细胞即为SP表型细胞。〖HTW〗结论〓〖HTK〗人胃癌BGC-823细胞系中存有SP细胞，且该表型细胞表达干细胞标志物ABCG2。     

乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群初步研究

目的:检测不同乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群含量,并探讨使乳腺癌细胞系MCF-7中肿瘤干细胞相关亚群富集的方法.方法:利用流式细胞仪检测3种乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s中SP细胞(side population cells)比例及CD44 CD24-/low细胞比例.用Percoll不连续密度梯度法分离MCF-7细胞亚群,利用流式细胞仪筛选出SP细胞富集的亚群.用添加生长因子的无血清培养液培养MCF-7,检测其中CD44 CD24-/low细胞的比例.结果:MCF-7、MDA-MB-435s中SP细胞比例分别为3.61%和2.72%,MDA-MB-231中未检测到SP细胞.3种细胞系中CD44 CD24-/low细胞比例分别为0.87%、0.59%和94.04%.MCF-7经Percoll分选,D亚群SP细胞富集,比例高达25.23%.MCF-7中CD44 CD24-/low细胞比例随着无血清培养时间的增加而增加,3周时达29.35%.结论:SP检测与CD44 CD24-/low细胞检测是目前乳腺癌干细胞检测的两种常用方法,但两者在同一乳腺癌细胞系中的检测结果并不一致,两种方法均有一定的局限性.另外,Percoll分选或无血清培养均能使MCF-7中肿瘤干细胞相关亚群(SP细胞或CD44 CD24-/low细胞)富集.     

卵巢癌侧群细胞流式分选方法的建立及探讨

目的:探讨分选卵巢癌细胞株SKOV3中的侧群(side population,SP)细胞的荧光染料Hoechst33342的最佳染色浓度及SKOV3的最适细胞密度.方法:制备SKOV3细胞悬液,以荧光染料Hoechst33342和7-AAD染色,维拉帕米拮抗对照,选择不同浓度的Hoechst33342(2.5,3,4,5,6 mg/L)孵育1×106个/mL SKOV3细胞90 min,流式细胞仪检测SP细胞比例及活细胞比例;选取不同细胞密度的SKOV3细胞悬液(6×105,7×105,8×105,9×105,1×106个/mL),3 mg/L的Hoechst33342孵育90 min,流式细胞仪检测SP细胞比例及活细胞比例.结果:通过Hoechst33342蓝光和红光双参数图,SP细胞位于左下角两种荧光均很弱的区域.Hoechst33342浓度不变时,SP细胞比例随细胞密度的增加而升高;SKOV3细胞密度不变时,SP细胞比例及细胞活性随hoechst33342浓度升高而降低.卵巢癌SKOV3细胞株在细胞密度为8×105个/mL,加入终浓度为3 mg/L的Hoechst33342,37℃水浴90 min,为最佳染色条件,此时SP细胞比例为(1.12±0.104)％,且细胞保持良好的活性.结论:人卵巢癌细胞株SKOV3中存在SP细胞,Hoechst33342浓度及SKOV3细胞密度是影响SP细胞比例及细胞活性的重要因素.     

Huh7细胞中边缘群细胞分选及其增殖分裂能力的研究

目的:探讨Huh7细胞中边缘群细胞的分选及边缘群细胞在增殖及分裂能力方面与非边缘群细胞的差异,为肝癌的治疗探索新的思路。方法:采用流式细胞仪分选Huh7细胞中的边缘群细胞和非边缘群细胞,用荧光显微镜观察其胞内Hoechst33342荧光染色强度差异;以半定量RT-PCR测定ABCG2 mRNA表达水平的差异;应用免疫荧光染色检测ABCG2蛋白表达的差异并观察其增殖和不对称分裂能力的差异。结果:非维拉帕米处理组边缘群细胞比例约为2.22%,经维拉帕米阻断后边缘群细胞比例减少至0.74%;边缘群细胞中Hoechst33342的荧光强度明显较非边缘群细胞弱,在边缘群细胞中ABCG2 mRNA表达水平是非边缘群细胞的4.32倍(P<0.01),增殖能力是非边缘群细胞的2.7倍(P<0.01),且边缘群细胞能产生ABCG2(+)和ABCG2(-)子代细胞,而非边缘群细胞只能产生ABCG2(-)子代细胞。结论:Huh7细胞中存在少量边缘群细胞(2.22%),其增殖能力较非边缘群细胞强且具有不对称分裂能力(自我更新和定向分化),具有肿瘤干细胞的特性;因此边缘群细胞分选可以作为肿瘤干细胞分离的一种方法,并且在肿瘤的耐药和进展...     

乳腺癌干细胞的检测及Hedgehog信号通路关键分子的表达

目的:探讨乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中是否存在乳腺癌起始细胞(CD44+/CD24-/low)亚群;并分析Hedgehog信号通路在CD44+/CD24-/low乳腺癌起始细胞亚群中的表达.方法:应用荧光激活细胞分选方法检测与分选MCF-7和MDA-MB-231中的CD44+/CD24-/low细胞亚群和非CD44+/CD24-/low细胞亚群,并在激光共聚焦显微镜下进行观察确认.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测CD44+/CD24-/low细胞亚群和非CD44+/CD24-/low细胞亚群中Hedgehog信号通路重要基因PTCH(human patched gene)、SHH(sonic Hedgehog)、Gii-1(glioma-associated oncogene homoglog-1)和SMOH(smoothened homolog)的表达情况.结果:乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中CD44+/CD24-/low亚群,比例分别为(1.70±1.43)%和(94.2±1.2)%.乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的CD44+/CD24-/low亚群中Hedgehog信号通路处于明显活化状态,其中Hedgehog信号通路中重要下游信号分子Gii-1在MCF-7和MDA-MB-231细胞系CD44+/CD24-/low细胞亚群中的表达要明显高于非CD44+/CD24-/low细胞亚群(P分别为0.007和0.005).结论:乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中存在CD44+/CD24-/low干细胞标志细胞亚群,其中Hedgehog信号通路处于明显活化状态.     

人卵巢癌OVCAR3细胞系中侧群细胞的分离及其成瘤性、侵袭性的实验研究

目的  分离卵巢癌细胞系OVCAR3中的侧群(SP)细胞,并观察其成瘤性和侵袭性。 方法  利用流式细胞荧光激活分选法将卵巢癌OVCAR3细胞系分成SP和非侧群(non-SP)细胞两个亚群。对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和细胞球形成实验观察其体外成瘤能力;Transwell小室法检测两个亚群细胞的体外侵袭力。  结果  OVCAR3细胞株中外排Hoechst33342的SP细胞占13.1％,加入维拉帕米SP细胞的比例为1.8%。SP细胞的体外克隆形成率为(46.17±23.27)％,non-SP细胞仅为(6.17±3.06)％,SP细胞克隆形成率高于non-SP细胞(P<0.05);细胞球形成实验结果显示,SP细胞能在无血清的培养液中形成细胞球,而non-SP细胞则不能;Transwell侵袭实验结果显示,SP表型细胞穿过Matrigel基底膜的细胞数为(215.9±30.9)个,non-SP表型细胞仅为(60.9±10.5)个。  结论  卵巢癌OVCAR3细胞系中存在外排Hoechst33342荧光染料的SP细胞,其成瘤性、侵袭力均强于non-SP亚群细胞,表明SP表型的肿瘤细胞在卵巢癌的生长、侵袭及转移中具有重要的地位。     

CD55高表达在分离乳腺癌SP细胞中的作用研究

目的 探讨应用细胞CD55高表达的特性替代Hoechst 33342染色来分离乳腺癌SP细胞的可行性.方法 应用Hoechst33342及抗CD55抗体对两种乳腺癌细胞株进行荧光染色,应用FACS-Vantage和FACS Vantage SE分选SP和MP细胞、CD55高表达(CD55hi)和CD55低表达(CD55lo)细胞,对比2组细胞对血清缺失诱导的凋亡的耐受性及CD55hi和CD55lo细胞的克隆形成能力.结果 对分选的CD55hi和CD55lo细胞行Hoechst 33342染色,2组细胞分别位于SP和MP区域中.在血清缺失情况下,SP细胞和CD55hi细胞分别比MP细胞和CD55lo细胞对凋亡刺激具有更高的耐受性.CD55hi细胞较CD55lo细胞具有更强的克隆形成能力.结论 细胞CD55高表达的特性可以替代Hoechst 33342染色用于分离乳腺癌SP细胞.     

人早孕蜕膜组织干细胞的分离与鉴定

目的 探讨人早孕蜕膜组织是否存在干细胞亚群(SP细胞)及其生物学特性.方法 取孕早期人流后子宫蜕膜组织,酶消化法获得组织细胞悬液,经Hoeehst33342染色或与维拉帕米共染后,采用免疫荧光细胞分选法(FACS)鉴定和分选干细胞,并以条件培养基培养观察细胞的增殖和集落生成能力.结果 孕早期子宫蜕膜组织中存在SP干细胞,其平均含量为(0.8±0.7)%,且在体外长期培养后有细胞增殖和形成集落.不同孕周间SP干细胞含量差异无统计学意义(P>0.05).结论 孕早期子宫蜕膜组织中存在SP干细胞,并具有细胞增殖和集落生成能力.     

以慢病毒构建的GFP阳性卵巢肿瘤细胞中侧群细胞的分离和动物活体内示踪

 目的 通过慢病毒将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)基因转入卵巢癌细胞中,研究慢病毒感染对细胞泵出Hoechst 33342能力的影响,追踪GFP(+)侧群（side population,SP）细胞在裸鼠体内的荧光表达和肿瘤成像。方法 选用人卵巢癌细胞株HO-8910PM,以慢病毒感染GFP基因至人卵巢癌细胞株HO-8910PM,摸索以Ubiquitin启动子构建的慢病毒颗粒对该细胞的最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI)。以流式细胞仪分选表达GFP的卵巢癌细胞株,获得高纯度的GFP(+)HO-8910PM,检测GFP表达对Hoechst 33342染色的影响。再以流式细胞仪分选GFP(+)SP细胞,将分选的GFP(+)SP细胞注射入裸鼠皮下,观察GFP(+)SP细胞的致瘤能力,并在体内观测GFP(+)SP来源肿瘤的荧光成像。结果 Ubiquitin启动子构建的慢病毒感染不影响卵巢癌细胞拒染Hoechst 33342的能力,分选的GFP(+)SP细胞仍能在裸鼠体内形成表达GFP的肿瘤,成瘤能力和未感染细胞相比无显著变化,GFP阳性肿瘤在成像系统中可见荧光表达。结论 慢病毒感染不影响卵巢癌细胞拒染Hoechst 33342的能力,慢病毒感染后分选的GFP(+)SP细胞仍能在裸鼠体内形成表达GFP的肿瘤,成瘤能力和未感染细胞相比无显著变化,GFP标记可以作为研究卵巢癌细胞在动物活体内生物学行为的示踪标记。     

EGFR抑制剂对人结肠癌细胞株HT29中CD44+细胞及侧群细胞作用的研究

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂对人结肠癌细胞株HT29中CD44+细胞及侧群（SP）细胞的作用机制。方法应用Hoechst33342染色、流式细胞仪检测HT29中CD44+细胞以及SP细胞比例和成瘤性,并对不同浓度EGFR抑制剂吉非替尼作用后球囊形成及SP细胞比例、不同化疗药物处理后CD44+细胞比例进行分析与比较。结果空白对照组HT29中SP细胞比例为（3.82±0.08）%,经维拉帕米阻断后降为（0.34±0.03）%,吉非替尼10、15滋mol/L作用48h后HT29中SP细胞比例明显降低（均P＜0.01）,5-氟尿嘧啶（5-FU）作用48h后SP细胞比例变化不大（P＞0.05）。与空白对照组比较,吉非替尼7.5、10、15滋mol/L作用24、48h后CD44+细胞比例均明显降低（均P＜0.05）;且随着吉非替尼的浓度增大,CD44+细胞比例逐渐降低（P＜0.05）。与空白对照组比较,多烯紫杉醇、顺铂作用24、48h后CD44+比例均明显增大（均P＜0.05）。随着时间延长,加入不同浓度的吉非替尼对球囊形成均具有抑制作用。结论EGFR抑制剂对人结肠癌细胞株HT29中CD44+细胞及SP细胞具有生长抑制作用,且可抑制球囊形成。     

人宫颈癌侧群细胞的分选及其生物学特性的研究

目的通过人宫颈癌细胞中侧群细胞的富集、分离和鉴定,确定其肿瘤干细胞特性,探讨以侧群细胞作为宫颈癌干细胞研究切入点的可行性。方法收集40例宫颈癌患者的手术标本,通过原代培养、流式细胞荧光激活分选法将宫颈癌细胞分为侧群(side population,SP)细胞和非侧群细胞(non-side population,NSP)2个亚群,观察2组细胞的增生和分化能力,并进行裸鼠接种以观察其成瘤能力,化疗药物顺铂以不同浓度作用于SP细胞和NSP细胞后计算细胞抑制率,以评价2组细胞对化疗药物的耐受性。结果人宫颈癌细胞中侧群细胞的比例约为2.04%±0.93%,侧群细胞的比例随分化程度的降低而下降(P<0.05)。细胞生长曲线(MTT法)显示,SP细胞的体外增生能力明显强于NSP细胞(P<0.05);行裸鼠接种时,SP细胞表现出较强的致瘤性,只需1×103个即可致瘤,其致瘤能力是NSP细胞的100倍,且成瘤时间显著缩短;化疗药物顺铂以不同浓度分别作用于SP细胞与NSP细胞24h后,SP细胞的抑制率明显低于NSP细胞(P<0.05)。结论人宫颈癌细胞中存在外排Hoechst 33342荧光染料的SP细胞,分化越差的肿瘤细胞其SP细胞比例越低。宫颈癌SP细胞体外增生能力和裸鼠成瘤能力均强于NSP细胞,对化疗药物具有较强的耐受性,具备肿瘤干细胞的特性,可作为宫颈癌干细胞研究的切入点。     

PI3K/mTOR信号通路参与胰腺肿瘤干细胞样SP细胞生存增殖的调控

目的 分离鉴定胰腺癌中肿瘤干细胞样的侧群(SP)细胞亚群并探讨磷脂酰肌醇3-激酶/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/mTOR)信号通路对其生存与增殖的调控.方法 应用流式分析检测5个胰腺癌细胞系中SP细胞的含量.观察加入PI3K/mTOR)R信号通路特异性抑制剂LY294002或雷帕霉素培养后胰腺癌细胞PANC-1中SP细胞的含量变化.通过平板集落形成试验,NOD-SCID小鼠异种移植成瘤试验和移植瘤的SP再次分析评价PANC-1 SP细胞的自我更新和分化潜能.采用 MTT试验和集落形成试验检测LY294002或雷帕霉素对分选的SP细胞和非SP细胞的抑制作用.结果 除了BXPC-3,其他胰腺癌细胞系都存在维拉帕米敏感的SP细胞.SP细胞具有较高的集落形成能力(SP细胞:43.7%±3.1%,非SP细胞8.3%±1.6%,P=0.000)和成瘤能力(至少100倍于非sP细胞),并能够发生不对称分裂生成非SP细胞.加入LY294002或雷帕霉素培养后PANC-1中sP细胞的含量明显降低(LY294002,7.60%±0.27% vs 1.90%±0.22%,P=0.000;雷帕霉素,7.60%±0.27%vs 1.14%±0.20%,P=0.000).与非SP细胞相比,LY294002及雷帕霉素均优先抑制sP细胞.结论 SP细胞富集胰腺癌肿瘤干细胞.PI3K/mT0R信号通路参与对其生长增殖的调控,可能成为根治胰腺癌的治疗新靶点.     

人肺腺癌细胞系SPCA1边缘细胞亚群的初步分析

目的检测和分选人肺腺癌细胞系SPCA1中的边缘细胞,并对其表面标志进行初步分析。方法用流式细胞仪检测和分选SPCA1中的边缘细胞和主群细胞,并用细胞免疫化学和激光共聚焦检测ABCG2和CD133在SPCA1中的表达。结果边缘细胞亚群占SPCA1细胞的0.7%,维拉帕米阻断后减少至0.0%。细胞免疫化学结果显示ABCG2和CD133在SPCA1的边缘细胞中高表达,而在未分选的SPCA1细胞和主群细胞中则低表达。结论人肺腺癌细胞系SPCA1中存在边缘细胞,提示肺癌干细胞的存在。     

大鼠小肠黏膜边缘群细胞的生物学研究

目的：分离大鼠胎鼠小肠黏膜来源的边缘群（SP）细胞,并分析其生物学特性.方法：取Wistar大鼠胎鼠小肠全长,按文献[3]方法制作小肠黏膜的类器官片段并制备成单细胞悬液.使用Hoechst33342和PI染色后用流式细胞仪分选SP细胞.提取分选前后的细胞总RNA和蛋白,用实时定量PCR及Western-blot方法分别检测其中MSI-1RNA及MSI-1蛋白的表达水平.结果：大鼠胎鼠来源的小肠黏膜单细胞悬液中包含一个特定的细胞群体-SP细胞,染色液中加入维拉帕米后,SP细胞被阻断后消失.定量PCR检测显示SP细胞中MSI-1mRNA水平是分选前的8.125倍,是非SP细胞的20.077倍.Western-blot结果显示MSI-1蛋白水平明显高于分选前.结论：大鼠胎鼠的小肠黏膜SP细胞富集小肠黏膜干细胞,与小鼠来源SP细胞生物学特性基本一致.