反义miR-21抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖的体外研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖能力的效果和机制.方法 脂质体介导转染反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)下调U251人脑胶质瘤细胞株miR-21的表达.使用实时定量PCR和原位杂交法鉴定转染后U251细胞miB-21表达水平下调;MTY法评价AS-miR-21抑制U251细胞生长效果;流式细胞术检测转染后U251细胞周期分布和凋亡;采用细胞免疫荧光技术(PCNA、CyelinD1、Bcl-2、PTEN和Septin-7)评价转染后U251细胞肿瘤生物学性状改变.结果 MTT结果显示AS-miR-21转染组肿瘤细胞生长速度小于对照组与无义寡核苷酸(F=78.926,P=0.000)组;实时定量PCR法:AS-miR-21转染组miR-21表达下调为对照组0.042±0.012;LNA-miR-21原位杂交显示AS-miR-21转染组miR-21表达水平较对照组与无义寡核苷酸组下调;流式细胞术检测可见AS-miR-21转染组细胞周期存在G0/G1期阻滞(X2=14.160,P=0.007)且凋亡比例高于对照组与无义寡核苷酸组(F=23341.25,P=0.000);细胞免疫荧光法表明AS-miR-21治疗后U251细胞PCNA、CyclinD1、Bcl-2表达下调,PrEN、Septin-7表达上调.结论 以miR-21作为靶点抑制U251人脑胶质瘤细胞株生长结果肯定,miR-21可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

白藜芦醇抑制U251人胶质瘤细胞增殖及其相关机制的探讨

目的 探讨白藜芦醇（Res）对U251胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机制。方法 将不同浓度Res作用于U251胶质瘤细胞系，相差显微镜下观察其形态的变化，MTT法检测其对细胞生长增殖的抑制作用，流式细胞术（FCM）检测其对细胞周期的影响，用蛋白印迹（Western blot）检测Res处理前后U251细胞表皮生长因子受体（EGFR）、p53、p21、CDK4、CyclinD1、Bcl-2及caspase-3的表达，免疫组化分析MMP9、NFKB、P-AKT及AKT2的表达。结果 U251细胞经Res处理后，细胞形态发生一定变化，U251胶质瘤细胞的增殖被抑制，呈浓度和时间依赖性，细胞周期被阻滞在S期，Western blot检测显示EGFR、CyclinD1、CDK4、Bcl-2的表达降低，p21、p53、caspase-3蛋白表达升高，免疫组化检测显示MMP9，NFKB、P-AKT及AKT2的表达降低。结论 Res有可能通过调节EGFR及p53信号通路而抑制U251胶质瘤细胞的增殖和侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡。     

miR-451对胶质瘤细胞株A172生物学特征的影响

目的 研究miR-451对胶质瘤细胞株A172生物学特征的影响.方法 合成寡核苷酸miR-451拟似物(miR-451 mimics)转染胶质瘤细胞以上调miR-451的表达,real-time PCR检测转染后miR-451的表达,Western印迹法检测目标蛋白表达,应用流式细胞术、MTT法评价细胞生长和增殖的生物学特征变化.结果 转染miR-451 mimics后,real-time PCR检测提示miR-451表达升高,Western blot结果显示癌基因C-myc表达下降＞63.6%,细胞周期正向调节因子CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin E表达下降;细胞周期分析表明miR-451 mimics组进入G0/G1期的细胞数较对照组增多达17.4%,出现G0/G1期阻滞;MTT法分析显示miR-451 mimics组细胞生长受抑.结论 miR-451可以抑制人脑胶质瘤细胞生长和增殖能力,具有抑瘤作用.     

反义miR-155对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察敲低微小RNA-155(miR-155)的表达对人胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响.方法 脂质体介导转染miR-155反义抑制序列(AS-miR-155)下调入胶质瘤U251细胞中miR-155的表达,同时设未转染组和无义序列转染组.实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测转染后细胞miR-155的表达,四甲基偶氨唑盐(MTT)实验检测转染后细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)检测转染后细胞周期变化和凋亡情况.结果 与未转染组和无义序列转染组相比,miR-155 反义抑制序列转染组细胞miR-155表达下降;MTT实验结果显示细胞生长受抑;流式细胞术结果可见细胞出现G0/G1期阻滞,细胞凋亡率增高.结论 反义miR-155可抑制U251胶质瘤细胞生长增殖,促进其凋亡.miR-155可能成为治疗胶质瘤的候选靶标.     

miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响

目的 探讨miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响及可能机制.方法 体外培养胶质瘤U251细胞,实验组将miR-29c mimics转染至细胞,miR mimcs转染作为对照组.应用实时荧光定量PCR检测转染后miR-29c表达量的改变,MTT实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外侵袭实验分析miR-29c转染后细胞的体外侵袭能力,Western blot检测转染后转录因子YY1蛋白的表达.结果 荧光定量PCR结果显示:实验组miR-29c表达量为(106.65±15.51),较对照组显著上调(P＜0.01).与对照组比较,实验组U251细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.05),体外侵袭能力明显减弱(P＜0.01),YY1蛋白表达下调(P＜0.01).结论 miR-29c可能通过调控YY1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的生物活性.     

过表达MiR-494抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖

目的观察微小RNA-494(miR-494)对脑胶质瘤细胞U87增殖能力的影响。方法通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测5例瘤旁组织和14例胶质瘤样本中miR-494的表达水平,并且检测其在6种胶质瘤细胞系中的表达;将100 nmol/L miR-494 mimics瞬时转染至脑胶质瘤U87细胞,qRT-PCR检测miR-494表达情况;采用四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测对U87细胞周期的影响。结果与瘤旁脑组织相比,miR-494在胶质瘤中呈现低表达;U87细胞转染48 h后,miR-494 mimics组miR-494表达为对照组的357倍(P0.05);与对照组相比,miR-494 mimics转染后抑制了U87细胞的增殖能力(P0.05);S期细胞显著减少,而G1期细胞则明显增多。结论 miR-494在胶质瘤中低表达,过表达miR-494 mimics有效抑制了U87细胞的增殖,调节细胞周期S期降低G1期增多,提示miR-494有望成为胶质瘤治疗的分子靶点。     

叶酸/聚酰胺一胺介导miR -7抑制胶质瘤U251恶性表型的研究

目的 研究叶酸/聚酰胺-胺( FA/PAM AM)作为miR -7载体治疗胶质瘤U251的效果。方法将FA/PAMAM/miR -7络合物转染胶质瘤细胞株U251,绘制细胞生长曲线,检测细胞周期和细胞凋亡情况,Transwell体系检测瘤细胞迁移能力,软琼脂克隆实验检测细胞致瘤性;qRT - PCR方法检测miR -7水平,Western blot方法检测EGFR、PI3K和AKT2的蛋白表达。结果 获得稳定转染的U251细胞增殖速度减慢,细胞周期延长,凋亡细胞比例增多,细胞迁移能力、软琼脂克隆形成能力均有明显降低(P＜0.05);miR -7水平明显提高,EGFR、PI3K和AKT2蛋白水平均有一定程度降低(P＜0.05)。结论 FA/PAMAM能够高效投递miR -7基因至胶质瘤细胞,发挥肿瘤生长抑制作用。     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.     

下调HOXA5表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响

目的 探讨下调同源异型盒基因A5（HOXA5）表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法 应用生信分析方法,计算机检索CGGA数据库,下载mRNAseq-693和mRNAseq-325芯片数据,获取低级别胶质瘤（WHO分级Ⅱ级）和高级别胶质瘤（WHO分级Ⅲ、Ⅳ级）HOXA5 mRNA表达及病人生存信息;以HOXA5表达水平的平均值为界限,将高级别胶质瘤分为低表达组和高表达组。体外培养人胶质瘤细胞株U87和U251,使用Lipofectamine 2000法将HOXA5 siRNAs和阴性对照siRNAs分别转染U87和U251细胞;CCK-8和平板克隆形成实验评估胶质瘤细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期;免疫印迹法检测蛋白表达水平。结果 生信分析结果显示:高级别胶质瘤HOXA5表达水平均显著高于低级别胶质瘤（P<0.01）;HOXA5高表达组高级别胶质瘤病人中位生存时间较低表达组明显缩短（P<0.01）。体外细胞实验结果:敲低HOXA5表达,U87和U251细胞的增殖率和克隆集落数量显著降低（P<0.01）,U87和U251细胞G0/G1期细胞百分比显著增高（P<0.01）,U87和U251细胞CDK4蛋白表达水平显著降低（P<0.01）。结论 胶质瘤HOXA5呈高表达,病理级别越高,表达水平越高,病人生存预后越差。敲低HOXA5表达,明显降低CDK4表达,使细胞周期停滞在G0期,明显抑制胶质瘤细胞的增殖。     

P16、 CyclinD1、CDK4在肺纤维化鼠肺组织的动态表达及意义

背景：已有众多文献证实肺纤维化进程中肺组织肺泡上皮细胞进行性减少,但并未深究其原因。在肺纤维化进程中可能存在P16、CyclinD1、CDK4蛋白异常表达,P16-CyclinD1/CDK4细胞周期调控通路异常可能参与肺纤维化肺泡上皮细胞减少过程。 目的：研究P16、CyclinD1、CDK4在博来霉素（BLM）诱导小鼠肺纤维化肺组织中的动态表达及其意义。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2009-03/2009-09在江苏大学医学院实验室完成。 材料：健康雌性KM小鼠68只,体重(20±2) g,用于制备小鼠肺纤维化模型。 方法：68只小鼠随机分为博来霉素模型组(n=36)和生理盐水对照组(n=32),模型组气管内注射3.5 mg/kg的博莱霉素,对照组气管内注射相同体积的生理盐水,每组分别于造模后的3, 7, 14和28天随机选取8只小鼠处死, 取出左肺组织,常规制成4μm石蜡切片,取出右肺组织置于-70℃冰箱中留作Western blot。 主要观察指标：病理形态学观察;免疫组化定位和半定量检测肺组织P16、CyclinD1、CDK4蛋白表达;Western blot检测P16、CyclinD1、CDK4蛋白表达。 结果：小鼠64只进入结果分析,死亡4只,模型组小鼠分别于第14、20、22、26天各死亡1只。（1）HE染色：模型组病理组织切片示肺纤维化组肺损伤明显,出现典型肺纤维化改变。（2）免疫组化结果显示：①模型组肺组织P16、CDK4蛋白表达随时间增加而增强,CyclinD1蛋白表达随时间增加而减弱。②与对照组相比,P16、CDK4蛋白阳性细胞数量增多;CyclinD1蛋白3、7、14天阳性细胞数量多于同时间点对照组,28天则明显少于同时间点对照组。（3）Western blot结果显示：①模型组P16蛋白从7天起表达逐渐增加,P < 0.05;CDK4蛋白表达随时间增加而逐渐增加, P < 0.05;CyclinD1 蛋白表达随时间增加而逐渐减少,P < 0.05,但14天与28天无显著性差异。②与对照组相比,14、28天肺组织P16蛋白表达增多,P < 0.01;7、14、28天 CDK4蛋白表达增多,P<0.05;3、7天 CyclinD1 蛋白表达增多,P < 0.05;14、28天 CyclinD1 蛋白表达减少,P < 0.05。 结论：在肺纤维化进程中存在P16、CyclinD1、CDK4蛋白异常表达,P16-CyclinD1/CDK4细胞周期调控通路异常可能是肺纤维化肺泡上皮细胞减少的重要原因。     

Knockdown of CDK2AP1 by RNA interference inhibits cell growth and tumorigenesis of human glioma

Abstract

Previous reports support the role of cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1 (CDK2AP1) as a tumor suppressor that functions as a key player in cell cycle regulation. Although the misadjustment of CDK2AP1 has been revealed in several types of human malignancies, the functional role of CDK2AP1 in human glioma remains unknown. The present study was undertaken to investigate the effects of CDK2AP1 knockdown by RNA interference (RNAi) on glioma cell growth and tumorigenesis. We employed lentivirus-mediated RNAi to down-regulate CDK2AP1 expression in U251 and U373 cells. Knockdown of CDK2AP1 resulted in a significant reduction in U251 and U373 cell proliferation, as determined by MTT and colony formation assays. Cell cycle analysis showed CDK2AP1 silencing caused U251 cells arrest in G0/G1 phase, especially in the sub-G1 phase representing apoptotic cells. In vivo tumorigenesis was assessed using xenograft formation and CDK2AP1 depletion remarkably inhibited glioma growth and tumorigenesis. Taken together, these results suggest that CDK2AP1 siRNA may have an anti-tumorigenic effect on human glioma.     

MSP58基因小干扰RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的观察核微球蛋白58（MSP58）基因特异性siRNA（small interfering RNA）对神经胶质瘤U251细胞的体外增殖的影响。方法体外化学合成针对MSP58基因的siRNA,脂质体法转染神经胶质瘤细胞系U251,荧光显微镜观察转染效率,逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测MSP58基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑法（MTT法）绘制细胞生长曲线,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期。结果MSP58基因的特异性siRNA转染U251细胞后,MSP58的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖受到明显抑制;流式细胞仪检测显示转染后的U251细胞G2/M期细胞明显减少（P〈0.01）,S期细胞略有减少,G1期细胞明显增加（P〈0.01）,G1期发生明显阻滞。结论MSP58基因的特异性siRNA可明显抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,并引起G1期细胞阻滞。     

Establishment and partial characterization of five malignant glioma cell lines

Five malignant glioma cell lines (YMG1, 2, 3, 4, and 5) were established from surgical specimens obtained from patients with glioblastoma or anaplastic astrocytoma, and these lines were partially characterized. Three glioma cell lines (YMG1, 3, and 5) were weakly positive for GFAP by Western blot analysis and two cell lines were negative. S‐100 protein was positive in all glioma cell lines. The expression of p53, p16, p15, cyclin‐dependent kinase 4 (CDK4), and EGF receptor (EGFR) proteins was examined by Western blotting. YMG1 and 2 cell lines showed accumulation of p53 protein and loss of p16 and p15 expression. YMG3 and 4 showed accumulation of p53 protein and expression of p16 and p15 proteins. YMG5 revealed weak expression of p53 protein, suggesting wild‐type p53, and loss of p16 and p15 expression. All cell lines expressed various levels of CDK4 protein. YMG1, 2, and 3 showed higher EGFR protein expression and YMG4 and 5 showed lower EGFR expression compared to U251 glioblastoma cells, which express high levels of EGFR. Fluorescence in situ hybridization analysis for EGFR gene expression did not show any amplification in the glioma cell lines. Immunohistochemical studies revealed that the patterns of p53 and EGFR expressions in the original tumor tissues were mostly correlated with those in the malignant glioma cell lines. These results suggest that the characteristics of p53 and EGFR expression in the malignant glioma cell lines were passed over from the original tumor tissues. These newly established malignant glioma cell lines can be used for further analysis of the mechanisms of tumor growth and progression.     

隔蛋白7对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响

目的 检测SEVT7对胶质瘤细胞系U251的细胞周期、增殖、侵袭以及凋亡的影响.方法 流式细胞术分析转染SEPT7对细胞周期的影响,Western blot检测细胞周期因子表达变化,MTT法和Annexin V法评价SEFT7对U251细胞的增殖活性和凋亡的影响,Martrigel三维立体培养分析转染SEPT7后U251细胞侵袭能力的变化.结果 SEPT7使U251细胞G0/G1期阻滞,S期细胞比例(SPF)降低,增殖活性和侵袭能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡.结论 SEPT7抑制U251细胞侵袭、增殖,促进凋亡.结果 提示,SEPT7是对胶质瘤具有抑制作用的基因.