CagA对AGS细胞Ca2+相关蛋白磷酸化的影响

目的:分析幽门螺杆菌(H pllori)细胞毒素相关蛋白A(CagA)对人胃腺癌黏膜上皮细胞(AGS)Ca2 相关蛋白磷酸化的影响,进一步揭来H pylori的致病机制.方法:采用金属离子亲和吸附富集技术富集H pylori、H pylori CagA缺失株(H pylori △CagA)与AGs细胞相互作用4 h,以及培养相同时间的AGS细胞的磷酸化蛋白.利用二维凝胶电泳技术分离磷酸化蛋白,ImageMaster 2D分析软件识别差异蛋白,MALDI-TOF/OF质谱鉴定确认蛋白.结果:Hpylozi △ CagA作用的AGS细胞.与培养相同时间的AGS细胞比较表达量不变,而Hpylori △CagA作用的AGS细胞表达量发生了明显变化,表明此蛋白的变化是单纯由CagA引起的;此类蛋白点共鉴定出19个,其中3个蛋白点与Ca2 相关.钙离子结合蛋白(nucleobindin-2 precursor,CALNUC)在AGS细胞以及H pylori △CagA与AGS相互作用的2-D胶中表达量接近,而H pylori与AGS相互作用后该蛋白表达量明显降低.结论:H pylori △CagA进AAGS细胞可能会影响内质网、线粒体及高尔基体的钙稳态,诱发内质网、线粒体、高尔基体凋亡或增殖途径.而成为胃炎、胃溃疡、胃癌发生的诱因之一.     

人胃上皮细胞中幽门螺杆菌CagA相关未知磷酸化蛋白和磷酸化位点分析

背景：细胞毒素相关基因A蛋白（CagA）是Ⅰ型幽门螺杆菌（H.pylori）的主要毒力因子。H.pylori胃癌、胃炎相关株和CagA缺失（△CagA）株的蛋白质组学研究尚未发现CagA相关生物标记蛋白。目的：分析H.pyloriCagA阳性株和△CagA株作用后人胃上皮细胞中差异表达的未知磷酸化蛋白和磷酸化位点,为研究CagA的致病机制提供线索。方法：以金属离子亲和吸附富集技术富集经H.pylori标准株和△CagA株作用4h的人胃腺癌细胞株AGS的磷酸化蛋白,双向电泳（2-DE）分离蛋白,飞行时间质谱（TOF-MS）技术鉴定差异蛋白点。结果：H.pylori标准株作用后,AGS细胞FAM50A蛋白276位丝氨酸发生磷酸化,PQBP1蛋白227～251序列中有磷酸化位点。与H.pylori标准株相比,△CagA株作用于AGS细胞可引起至少13种未知磷酸化蛋白的变化,其质谱图中均出现中性丢失峰,其中2种表达量增加,4种表达量降低,6种消失,1种新发生磷酸化。结论：CagA阳性H.pylori感染可致AGS细胞FAM50A和PQBP1蛋白发生磷酸化。所发现的13种未知磷酸化蛋白为揭示CagA的致病机制提供了线索。     

幽门螺杆菌CagA与宿主细胞相互作用机制的研究进展

细胞毒素相关蛋白A（CagA）是幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染导致宿主产生炎性反应的重要效应蛋白。H.pylori感染后通过cag PAI编码的Ⅳ型分泌系统将CagA注入宿主细胞内并发生磷酸化,导致细胞内信号传导等一系列的反应。作为H.pylori的一个重要致病因子,CagA蛋白是目前研究的热点之一。本文主要概述了CagA的特征,以CagA易位进入胃黏膜上皮细胞直至引起细胞内信号传导发生改变为主线,综述了近年来与之相关的研究和发现。     

不同种族幽门螺杆菌菌株CagA蛋白羧基端结构和生物学功能的差异

目的比较不同种族H.pylori菌株CagA蛋白羧基端结构以及诱导AGS细胞延伸、分泌IL-8能力的差异。方法 PCR扩增CagA3′端可变区DNA序列并进行测序,获得CagA3′端可变区氨基酸序列。以不同H.pylori菌株与AGS细胞孵育,观察AGS延伸细胞的百分数,测定细胞培养上清IL-8含量。结果美籍亚裔和美籍非裔菌株的CagA羧基端氨基酸第3个EPIYA前后的氨基酸序列存在明显差异。不同种族cag PAI+H.pylori导致AGS细胞延伸、分泌IL-8能力无明显差异。cag PAI+H.pylori诱导细胞延伸AGS细胞、分泌IL-8的能力明显大于cag PAI-H.pylori。结论不同种族H.pylori菌株CagA蛋白羧基端结构存在差异。H.py-lori菌株诱导AGS细胞延伸、分泌IL-8的能力与cag PAI有关。     

幽门螺杆菌cagA基因3''''端可变区和CagA蛋白EPIYA基序研究进展

细胞毒素相关基因A（cagA）编码CagA蛋白，是研究最多的幽门螺杆菌（H．pylori）基因之一。CagA蛋白经由Ⅳ型分泌系统进入Hpylori黏附的胃上皮细胞，其C-端发生酪氨酸磷酸化，磷酸化的CagA可引起细胞骨架重排、诱导细胞发生形态学变化、增强细胞动力，造成细胞异常运动和增殖．最终导致癌变。因此cagA阳性H．pylori菌株较cagA阴性菌株毒力更强。cagA基因3’端可变区重复序列数目的差异造成了cogA基因结构的多态性以及CagA蛋白大小、功能和细菌毒力（致病性）的差异。因此，cagA基因3’端可变区及其蛋白的EPIYA基序与H．pylori感染临床结果的相关性，成为目前H.pylori研究的热点之一。     

不同疾病来源幽门螺杆菌菌株对人胃癌细胞系AGS基质金属蛋白酶表达影响的比较研究

背景：幽门螺杆菌（H.pylori）是胃癌的Ⅰ类致癌原，但H.pylori感染与胃癌发生的分子机制仍不明了。目的：在体外观察不同疾病来源的H.pylori菌株对人胃癌细胞系AGS基质金属蛋白酶（MMPs）表达的影响是否存在差异。方法：将AGS细胞分别与5株分离自胃癌和5株分离自轻度非萎缩性胃炎患者的H.pylori共培养，以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测MMP-2、MMP-7和MMP-9 mRNA和蛋白的表达，以肠道致病性大肠杆菌作为细菌对照。结果：胃炎H.pylori菌株和大肠杆菌基本不影响AGS细胞MMP-2、MMP-7和MMP-9 mRNA和蛋白的表达，而所有胃癌菌株均能上调MMP-2、MMP-7和MMP-9 mRNA和蛋白的表达。结论：分离自胃癌和胃炎患者的H.pylori菌株对AGS细胞MMP-2、MMP-7和MMP-9表达的影响有所不同，说明不同疾病来源的H.pylori菌株在促细胞恶变能力上存在差异。     

Claudin在幽门螺杆菌和AGS细胞相互作用不同时间点表达分析

目的研究Claudin家族成员在Helicobacterpylori（H．pylori）和AGS相互作用的不同时间点表达谱变化。方法TRIzol方法提取H．pylori26695攻击AGS细胞0、0．5、2、4、6h时间点的细胞总RNA样品，对样品mRNA进行线性扩增后，应用IlluminaHuman-6芯片检测基因表达量，以DetectionScore≥0．99；IDiffScoreI≥13；方差分析（ANOVA）P≤0．05作为筛选差异基因的标准；比较Claudin家族成员的表达量．结果Claudin家族有4个成员存在差异表达，其中在早期Claudin15下调，4h后无差异，Claudin2、23早期上调后于4h和6h分别恢复至无差异水平，而Claudin6在0．5h后持续上调。结论Claudin蛋白家族2、6、15、23成员参与H．pylori感染过程，并且呈现时序性变化，为H．pylori感染能引发胃癌机制研究提供线索。     

常氧与低氧下CagA~+幽门螺杆菌对人胃癌SGC7901细胞系HIF-2α、ABCG2表达的影响

目的:观察常氧与低氧下CagA+幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)对人胃癌SGC7901细胞系低氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2alpha,HIF-2α)、ABCG2表达的影响,初步探讨H.pylori在胃癌发生发展中的干细胞机制,及其与肿瘤微环境低氧的协同作用.方法:内镜下采集胃黏膜标本,行H.pylori培养并鉴定,PCR方法检测H.pyloriCagA+基因.CagA+H.pylori与胃癌SGC7901细胞于常氧和低氧环境下共培养48h(分常氧对照组、低氧对照组、常氧CagA+H.pylori组、低氧CagA+H.pylori组).免疫细胞化学法检测HIF-2α和ABCG2蛋白的表达,RT-PCR法检测ABCG2 mRNA的表达.结果:免疫细胞化学结果显示:常氧下胃癌SGC7901细胞HIF-2α、ABCG2蛋白呈低水平表达,低氧和CagA+H.pylori均能显著诱导HIF-2α、ABCG2蛋白表达(与常氧对照组相比,均P0.01),与低氧对照组和常氧CagA+H.pylori组相比,低氧CagA+H.pylori组表达进一步升高(均P0.01).相关分析显示HIF-2α与ABCG2表达呈正相关(r=0.976,P0.05).RT-PCR检测ABCG2 mRNA表达结果与免疫细胞化学一致.结论:CagA+H.pylori可刺激胃癌细胞HIF-2α、ABCG2表达,低氧环境下其表达进一步增加,表明CagA+H.pylori和低氧对HIF-2α、ABCG2的表达有协同作用.提示CagA+H.pylori和低氧可能是诱导胃癌细胞干细胞化及化疗抵抗的重要原因.     

敲低hnRNP H基因对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和细胞周期的影响及意义

目的探讨不均一核糖体蛋白H(hnRNP H)siRNA敲低hnRNP H基因表达及其对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和周期的影响。方法将hnRNP H基因的小干扰RNA(siRNA)转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞株,细胞分对照组、阴性对照、siRNA组,通过实时定量PCR和Western印迹检测hnRNP H mRNA和蛋白水平,以确定siRNA转染效率。通过MTT实验检测各组细胞增殖情况;Western印迹检测三组细胞增殖蛋白PCNA核增殖抗原和细胞周期cyclin D1、CDK4的蛋白水平。结果敲低子宫内膜癌Ishikawa细胞hnRNP H基因的表达能有效抑制肿瘤细胞的生长,使增殖蛋白PCNA下降,下调细胞周期蛋白cyclin-D1、CDK4的表达。结论敲低hnRNP H基因可能是子宫内膜癌基因治疗靶点。     

幽门螺杆菌诱导胃黏膜细胞AGS产生IFN-γ的研究

目的用幽门螺杆菌诱导胃黏膜细胞AGS产生IFN-γ,探讨胃黏膜细产生IFN-γ的机制。方法用幽门螺杆菌感染胃黏膜细胞株AGS,用RT-PCR测定细胞表达IFN-γ的RNA,用ELISA法测定细胞产生的IFN-γ蛋白;用幽门螺杆菌的主要毒力CagA阳性质粒转染细胞,ELISA测定细胞产生的IFN-γ;CagA阳性质粒转染细胞后加入MeK/ErK、Src、P38和NF-kB的抑制剂,用ELISA测定细胞产生IFN-γ的变化。结果 AGS细胞感染幽门螺杆菌后可检测到IFN-γRNA和蛋白的表达,CagA阳性质粒转染细胞后引起IFN-γ蛋白的表达,MeK/ErK、P38和NF-kB引起IFN-γ表达量下降。结论幽门螺杆菌感染胃黏膜细胞AGS诱导产生IFN-γ,幽门螺杆菌的主要毒力CagA可诱导IFN-γ的产生,CagA诱导IFN-γ的产生依赖于MeK/ErK、P38和NF-kB三者参与的信号途径。     

幽门螺杆菌作用后AGS细胞内钙离子的动态变化研究

背景幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染与胃癌发生密切相关,但致病机制尚未清晰。细胞毒素相关蛋白A(CagA)是Ⅰ型Hp的主要毒力因子,在Hp诱导的疾病特别是胃癌的发展中起重要作用。前期的研究发现,Hp作用后人胃腺癌上皮细胞(AGS)的钙离子相关蛋白钙网织蛋白CRT以及钙离子结合蛋白CALNUC磷酸化程度发生改变,提示Hp可能会影响AGS细胞的钙稳态,通过钙离子通路影响细胞的增殖或凋亡。目的研究Hp作用于人胃腺癌上皮细胞后,AGS细胞内钙离子的时序性变化,以及CagA对AGS细胞内钙离子的影响,进一步揭示Hp的致病机制。方法采用钙离子荧光标记示踪法,AGS细胞以Fluo-3/AM荧光指示剂负载,特异性地活体标记AGS内的钙离子,采用激光共聚焦显微镜观察分析Hp26695及其CagA缺失株(Hp26695△CagA)分别作用于AGS细胞1h、2h、3h、4h、5h、6h后,AGS细胞内钙离子的变化情况。结果幽门螺杆菌与AGS细胞相互作用1h,胞内Ca2+部分流失,5h胞内Ca2+大量流失。1～6h内,Hp26695与Hp26695△CagA作用的AGS细胞荧光强度没有显著差异。结论Hp作用会导致AGS细胞内Ca2+剥夺,且与CagA的存在无明显关联性。     

幽门螺杆菌CagA C-端功能域特征及其生物学功能研究

目的　克隆源自临床分离的幽门螺杆菌 (Hp)菌株CagADNA序列 ,比较其C 端氨基酸序列与国外菌株的差异 ,并分析其磷酸化能力和转染胃上皮细胞后的生物学功能。方法　从 39株临床分离的HpDNA基因组中用PCR方法扩增cagAC 端DNA ,经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收DNA片段进行测序。分别构建cagA的原核细胞和真核细胞表达载体并进行CagAC 端氨基酸磷酸化能力测定。 结果　有 38株菌株检测到CagADNA片段 ,CagA阳性率为 97.4 % (38/ 39)。测序后发现 ,克隆的 38株阳性菌株CagA蛋白均仅含 1个重复序列和 2～ 4个串联的谷氨酸 脯氨酸 异亮氨酸 酪氨酸 丙氨酸(EPIYA)序列 ,且在重复序列的D2区氨基酸序列均为天冬氨酸 苯丙氨酸 天冬氨酸 (DFD)。来自胃癌和非胃癌患者的CagA蛋白串联的EPIYA序列数目差异无显著性。用原核细胞表达的CagA蛋白进行体外磷酸化试验 ,重复序列中的酪氨酸能被磷酸化 ,其余的在EPIYA中的酪氨酸也能被磷酸化 ,但转染的AGS细胞株中仅重复序列中的酪氨酸能被磷酸化。在转染AGS细胞株后少数细胞 (<10 % )因骨架重构而出现典型的“蜂鸟”样改变 ,与直接用Hp感染AGS细胞时类似 ,且对转染的AGS细胞再用Hp感染后 ,其“蜂鸟”样细胞的百分比也无明显增加。结论　源自国人的HpCagA蛋白结构不同于欧美国家     

Determinants and consequences of different levels of CagA phosphorylation for clinical isolates of Helicobacter pylori

BACKGROUND & AIMS: The Helicobacter pylori cag pathogenicity island encodes a secretory system that translocates CagA into epithelial cells, where it becomes tyrosine phosphorylated and induces cytoskeletal rearrangements. Strains with more CagA tyrosine phosphorylation motifs are most closely associated with gastric cancer. Here we assess whether clinical strains can deliver CagA, whether strains with different numbers of CagA phosphorylation motifs have CagA phosphorylated to different degrees, and whether this induces different amounts of epithelial cytoskeletal change. METHODS: Forty-four H. pylori strains from South African patients, all cagA gene positive, were cocultured with the gastric adenocarcinoma cell line AGS. CagA expression and phosphorylation were determined by Western blot and interleukin-8 secretion by enzyme-linked immunosorbent assay. The cagA 3' variable regions of 22 strains were sequenced and shown to possess 3-6 phosphorylation motifs. These strains were used to quantify CagA phosphorylation and cytoskeletal rearrangements. RESULTS: cagA genotype and typing of cag pathogenicity island genes were poorly predictive of phenotype. Thirty-four of 44 strains expressed CagA protein that could be delivered to and phosphorylated within AGS cells. Only these 34 strains induced interleukin-8 secretion from AGS cells. Among those strains, the number of CagA tyrosine phosphorylation motifs determined the degree of CagA phosphorylation and the level of biologic activity in terms of degree and extent of AGS cell elongation. CONCLUSIONS: H. pylori strains that deliver CagA with more phosphorylation motifs induce higher levels of CagA phosphorylation in epithelial cells, induce more cytoskeletal changes, and are more likely to be associated with gastric cancer.     

Characterization of CagA variable region of Helicobacter pylori isolates from Chinese patients

AIM: To characterize the CagA variable region of Helicobacter pylori isolates from Chinese patients. METHODS: DNA fragments in CagA variable region were amplified and sequenced respectively from genomic DNA of 19 isolates from patients with gastric cancer and 20 isolates from patients with chronic gastritis. The tendency of phosphorylation in tyrosine(s) of CagA proteins was evaluated subsequently by phosphorylation assay in vivo and in vitro respectively. RESULTS: About 97.44% (38/39) H pylori isolates possessed CagA gene. CagA+ strains contained 2-4 tandem five-amino-acid motifs EPIYA but only one EPIYA had repeated sequence in CagA variable region in different isolates. There was no significant difference between the number of EPIYA motifs in H pylori from patients with different diseases. However, only tyrosine site in EPIYA within repeated sequence could be phosphorylated by AGS cells in vivo although all tyrosine sites in EPIYA could be phosphorylated in vitro. CONCLUSION: CagA in Chinese has no functional difference in perturbing cellular signal pathway among different H pylori isolates.     

Influence of EPIYA-repeat polymorphism on the phosphorylation-dependent biological activity of Helicobacter pylori CagA

BACKGROUND & AIMS: Helicobacter pylori CagA-positive strain is associated with gastric adenocarcinoma. CagA is delivered into gastric epithelial cells, where it undergoes tyrosine phosphorylation at the EPIYA sites by Src family kinases (SFKs). Owing to homologous recombination within the 3'-region of the cagA gene, 4 distinct EPIYA sites, each of which is defined by surrounding sequences, are variably assembled in both number and order among CagA proteins from different clinical H pylori isolates. Tyrosine-phosphorylated CagA specifically binds and deregulates SHP-2 via the Western CagA-specific EPIYA-C or East Asian CagA-specific EPIYA-D site, and C-terminal Src kinase (Csk) via the EPIYA-A or EPIYA-B site. Here we investigated the influence of EPIYA-repeat polymorphism on the CagA activity. METHODS: A series of EPIYA-repeat variants of CagA were expressed in AGS gastric epithelial cells and the ability of individual CagA to bind SHP-2 or Csk was determined by the sequential immunoprecipitation and immunoblotting method. RESULTS: CagA proteins carrying multiple EPIYA-C or EPIYA-D sites bound and deregulated SHP-2 more strongly than those having a single EPIYA-C or EPIYA-D. Furthermore, the ability of CagA to bind Csk was correlated with the number of EPIYA-A and EPIYA-B sites. Because Csk inhibits SFK, CagA with greater Csk-binding activity more strongly inhibited Src-dependent CagA phosphorylation and more effectively attenuated induction of cell elongation caused by CagA-SHP-2 interaction. CONCLUSIONS: EPIYA-repeat polymorphism of CagA greatly influences the magnitude and duration of phosphorylation-dependent CagA activity, which may determine the potential of individual CagA as a bacterial virulence factor that directs gastric carcinogenesis.     

曲古霉素A对人胃癌细胞的抑制作用及其机制探讨

背景：组蛋白去乙酰基酶抑制剂（HDACi）是一类新型抗肿瘤药物。曲古霉素A（TSA）是目前研究最为广泛的HDACi之一,已发现其对多种肿瘤细胞具有明显抑制作用,但关于TSA对胃癌作用的研究尚少。目的：观察TSA对人胃癌细胞增殖、凋亡、细胞周期以及相关基因表达的影响,探讨其抑制人胃癌细胞的可能作用机制。方法：以不同浓度TSA（0—1μmol／L）处理人胃癌细胞株AGS和HGC-27。CCK-8实验检测细胞增殖抑制情况,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,realtimeRT-PCR和蛋白质印迹法检测细胞凋亡、细胞周期相关基因mRNA和蛋白水平的表达。结果：TSA能剂量依赖性地抑制AGS、HGC-27细胞增殖（P=0．000）,对两者的半数致死浓度分别约为0．25μmol／L和0．5μmol／L。TSA能诱导AGS、HGC-27细胞发生G0／G1期和G2／M期阻滞,以G0／G11期阻滞更为明显。TSA对AGS细胞的诱导凋亡作用强于HGC-27细胞（P〈0．05）。TSA尚能上调p21、p53、BaxmRNA和蛋白表达,下调Bel-2、CDK2、cyelinD1mRNA和蛋白表达,作用均呈时间依赖性（P〈0．05）。结论：TSA抑制人胃癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用可能是通过调节细胞凋亡、细胞周期相关分子、激活多种肿瘤相关信号通路实现的。     

Biological activity of the Helicobacter pylori virulence factor CagA is determined by variation in the tyrosine phosphorylation sites

Helicobacter pylori is a causative agent of gastritis and peptic ulcer. cagA(+) H. pylori strains are more virulent than cagA(-) strains and are associated with gastric carcinoma. The cagA gene product, CagA, is injected by the bacterium into gastric epithelial cells and subsequently undergoes tyrosine phosphorylation. The phosphorylated CagA specifically binds SHP-2 phosphatase, activates the phosphatase activity, and thereby induces morphological transformation of cells. CagA proteins of most Western H. pylori isolates have a 34-amino acid sequence that variably repeats among different strains. Here, we show that the repeat sequence contains a tyrosine phosphorylation site. CagA proteins having more repeats were found to undergo greater tyrosine phosphorylation, to exhibit increased SHP-2 binding, and to induce greater morphological changes. In contrast, predominant CagA proteins specified by H. pylori strains isolated in East Asia, where gastric carcinoma is prevalent, had a distinct tyrosine phosphorylation sequence at the region corresponding to the repeat sequence of Western CagA. This East Asian-specific sequence conferred stronger SHP-2 binding and morphologically transforming activities to Western CagA. Finally, a critical amino acid residue that determines SHP-2 binding activity among different CagA proteins was identified. Our results indicate that the potential of individual CagA to perturb host-cell functions is determined by the degree of SHP-2 binding activity, which depends in turn on the number and sequences of tyrosine phosphorylation sites. The presence of distinctly structured CagA proteins in Western and East Asian H. pylori isolates may underlie the strikingly different incidences of gastric carcinoma in these two geographic areas.     

幽门螺杆菌对人胃癌细胞株AGS侵袭力的影响

背景：幽门螺杆菌（H．pylori）为人类胃癌的Ⅰ类致癌原,但其在胃癌演进中的作用仍未完全阐明。目的：体外观察Hpylori对人胃癌细胞株AGS侵袭力的影响。方法：将AGS细胞与H．pylori标准菌株NCTC11637共培养72h．光学显微镜观察12—72h时细胞形态变化,扫描电镜观察24h时细胞形态变化。侵袭小室实验检测共培养24h后AGS细胞的侵袭力。结果：AGS细胞与H．pylori共培养12h后,细胞渐出现变形,伪足增多、伸长．24h和48h时细胞间相互离散,伸出细长伪足,呈“蜂鸟”表型,60h和72h时细胞出现空泡样变,死亡逐渐增多;扫描电镜下可见Hpylori黏附于AGS细胞表面,细胞变形明显,伸出细长伪足。侵袭小室实验显示与H．pylori共培养24h的AGS细胞,每200倍视野下穿膜细胞数显著高于PBS对照组（130．4±11．5对87．1±9．3．P〈0．01）。结论：Mpylori感染可影响人胃癌细胞株AGS的细胞形态,增加细胞侵袭力。