去氢骆驼蓬碱诱导HepG2细胞凋亡并增强其对5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性

 目的:研究去氢骆驼蓬碱体外诱导HepG2细胞凋亡过程中c-Jun N末端激酶（JNK）途径的作用,并观察其联合化疗药物对HepG2细胞的影响。方法:CCK-8法检测联合或不联合使用JNK特异性抑制剂SP600125对细胞增殖的抑制作用;克隆形成实验观察不同浓度药物对细胞克隆形成的影响;Hoechst 33258染色法观察细胞形态变化;PI单染检测细胞亚二倍体率;Annexin V-PI双染测定细胞早期凋亡水平;Western blotting检测细胞聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、JNK和p-JNK蛋白表达的改变;联合5-氟尿嘧啶（5-FU）或顺铂(DDP)观察细胞对化疗药物的敏感性。结果:去氢骆驼蓬碱随药物浓度的升高而抑制作用增强,48 h后IC50为9.80 mg/L;去氢骆驼蓬碱能显著抑制细胞克隆形成,并且导致细胞凋亡形态学变化;PI单染检测发现细胞周期的G1期前有亚二倍体凋亡峰,Annexin V-PI 双染检测细胞出现明显的早期凋亡细胞群;Western blotting检测到随着去氢骆驼蓬碱浓度增加PARP及p-JNK蛋白表达增加,JNK蛋白表达减少;联合使用SP600125对细胞增殖的抑制作用减弱;联合5-FU或顺铂明显增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用,增敏倍数分别为1.47和5.78倍。结论: 去氢骆驼蓬碱对HepG2细胞有增殖抑制作用,并诱导其凋亡,激活JNK信号通路可能是其主要机制之一;同时去氢骆驼蓬碱可以增强HepG2细胞对5-FU和顺铂的敏感性。     

shRNA介导的hWAPL表达沉默对人宫颈癌CaSki细胞增殖与凋亡的影响

 目的： 为探讨人半翼(hWAPL)蛋白在细胞增殖与凋亡中的作用及其作为分子靶点用于肿瘤治疗的潜在价值,本研究用RNA干扰技术抑制hWAPL基因的表达,并观察了其对人宫颈癌细胞CaSki细胞增殖和细胞凋亡的影响。方法：实时荧光定量PCR和Western blotting 检测hWAPL shRNA的干扰效率;MTT检测细胞增殖;Annexin V-PE和 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡;蛋白质印迹分析凋亡蛋白cleaved caspase-3和细胞周期抑制蛋白p21、p27的表达。裸鼠荷瘤模型体内研究hWAPL沉默对CaSki细胞增殖的影响。结果：实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果表明,筛选到的hWAPL shRNA能有效抑制内源hWAPL的表达。MTT实验表明 shRNA介导的hWAPL表达沉默显著抑制CaSki细胞的增殖。Annexin V-PE分析结果表明, hWAPL 沉默增加了凋亡细胞数目。细胞核经Hoechst　33258染色出现浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光; 蛋白质印迹结果显示cleaved caspase-3、 p21和p27表达增加;裸鼠成瘤实验表明,hWAPL 沉默的肿瘤体积减小,增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达增加。结论：hWAPL沉默抑制CaSki细胞增殖,促进细胞凋亡,是一个潜在的肿瘤治疗新靶点。     

热休克蛋白70在人食管癌EC9706细胞凋亡过程中的表达与定位变化

目的 探讨姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用,热休克蛋白70(HSP70)在肿瘤细胞凋亡过程中在核基质上的变化及其与凋亡调控相关蛋白的关系.方法 用细胞计数和流式细胞仪检测姜黄素对人食管癌EC9706细胞的增殖抑制作用,以光学显微镜和透射电镜观察姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡前后的细胞结构变化,琼脂糖凝胶电泳观察人食管癌EC9706细胞凋亡前后的DNA结构变化.双向凝胶电泳和质谱鉴定分析HSP70在核基质中的存在与变化;并以Western blotting进行确证;激光扫描共焦显微镜观察HSP70在EC9706细胞凋亡过程中的定位及其与Bax、Bcl-2等基因产物的共定位关系.结果 姜黄素能显著抑制人食管癌EC9706细胞增殖并诱导人食管癌EC9706细胞凋亡,双向凝胶电泳、质谱鉴定和结果 发现并证实,HSP70在姜黄素处理前后的EC9706细胞核基质蛋白中的存在及其表达下调变化.激光扫描共焦显微镜观察结果 显示,HSP70在EC9706细胞凋亡过程中与Bax、Bcl-2等基因产物具有共定位关系,且其共定位区域发生了变化.结论 姜黄素对人食管癌EC9706细胞具有显著的凋亡诱导作用;HSP70作为一种新发现的核基质蛋白,在姜黄素诱导人食管癌EC9706凋亡过程中的表达与分布发生了显著变化.HSP70与凋亡相关基因的关系对EC9706细胞凋亡具有重要影响.     

噻可拉林协同顺铂促进宫颈癌c4-1及Hela细胞凋亡机制的研究

目的：探讨噻可拉林协同顺铂促进宫颈癌c4-1、Hela细胞凋亡的机制。方法：用不同浓度噻可拉林和顺铂单独或联合作用于体外培养的c4-1、Hela细胞,MTT法检测c4-1、Hela细胞生长抑制率,Hoechst 33342 和AO-EB染色法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞Bax、Bcl2、p53、p21蛋白的表达,流式细胞术检测细胞增殖周期。结果：c4-1及Hela细胞经不同浓度的噻可拉林和顺铂单独或联合作用后,细胞的体外增殖活力被明显抑制,呈剂量依赖关系,且在联合使用噻可拉林（10 nmol/L）：顺铂（4 μmol/L）用量时抑制效果最明显（P<0.05）;AO-EB染色法显示,噻可拉林和顺铂联合使用,细胞凋亡更明显。Western blot则显示,Bax、p53、p21表达明显上调,而Bcl2的表达则明显下调。结论：噻可拉林能协同顺铂上调Bax、p53、p21的表达和下调Bcl2的表达,抑制宫颈癌c4-1、Hela细胞增殖同时促进细胞凋亡。     

miR-24-3p靶向KLF6基因调控IL-6/STAT3信号通路影响食管癌细胞的活力和凋亡

目的:探讨微小RNA-24-3p(miR-24-3p)对食管癌细胞活力和凋亡的影响及机制。方法:以人正常食管上皮细胞HEEC为对照,采用RT-qPCR检测食管癌细胞TE11、Eca109和EC9706中miR-24-3p和KLF6 mRNA的表达,Western blot检测KLF6蛋白的表达。用anti-miR-24-3p和KLF6 siRNA转染EC9706细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测检测细胞中与增殖、凋亡相关的蛋白以及IL-6/STAT3信号通路相关蛋白的表达,ELISA法检测IL-6的表达。双萤光素酶报告基因实验验证miR-24-3p与KLF6靶向调控的关系。结果:食管癌癌细胞TE11、Eca109和EC9706中miR-24-3p表达上调(P<0.05),KLF6的mRNA和蛋白表达下调(P<0.05)。敲减EC9706细胞miR-24-3p表达可抑制其细胞活力,诱导其凋亡,并抑制细胞CDK4、cyclin D1、CDC25A、p-STAT3、IL-6及Bcl-2的表达,促进caspase-3和Bax的表达。结论:miR-24-3p可靶向KLF6基因调控IL-6/STAT3信号通路影响食管癌细胞的生长和凋亡。     

DIM增强顺铂抑制PC-3细胞增殖及诱导凋亡的效应

目的：观察顺铂(DDP)和3，3-二吲哚基甲烷(3,3-diindolylmethane ,DIM)联合应用对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用MTT法检测PC-3细胞增殖抑制情况，用流式细胞术及吖啶橙染色法分析细胞凋亡的变化，用RT-PCR检测抑癌基因p21的表达变化。结果:60 μmol.L-1的DIM 与0.4 mg·L^-1的DDP 联合可有效抑制PC-3细胞增殖并诱导其凋亡，其效果与单用4 mg·L-1DDP相同。DIM与DDP联合试验中细胞生长抑制率和凋亡率也明显高于单用DIM处理组（P＜0.05）。RT-PCR结果表明：单用DIM和DIM与DDP联合用药都能明显增强p21基因的表达，但联合用药的效果更明显。结论:DIM能显著增强DDP对PC-3细胞的增殖抑制和诱导凋亡的效应。     

虫草素增强顺铂诱导的食管癌细胞系Eca109凋亡

目的研究虫草素与顺铂联合用药对食管癌细胞Eca109凋亡的影响及其作用机制。方法将食管癌细胞Eca109分为对照组、不同浓度虫草素处理组、不同浓度顺铂处理组和虫草素(70μg/m L)与顺铂(0.8μg/m L)联合处理组。MTS法检测Eca109细胞增殖;Hoechst 33258染色法及流式细胞术检测Eca109细胞凋亡;Western blot法检测细胞核内NF-κB P65及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平;ELISA法检测细胞核内NF-κB P65与DNA的结合活性。结果虫草素与顺铂联合应用使顺铂对Eca109细胞的抑制率由29.30%增加至70.41%(P0.05),增强了顺铂对Eca109的敏感性;与顺铂单独用药相比,联合用药能够显著增加顺铂诱导的细胞凋亡(P0.05);与对照组相比顺铂能够增加细胞核内NF-κB P65的活性,而虫草素却能抑制NF-κB P65的活性,联合用药后NF-κB P65的活性下调;与虫草素和顺铂单独用药相比,联合用药组能够使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(P0.05),而促凋亡蛋白Bax表达则显著增高(P0.05)。结论虫草素可能通过抑制NF-κB途径,调节下游信号分子Bcl-2和Bax的表达,增强顺铂对Eca109的凋亡诱导效应。     

慢病毒介导的mcl-1-shRNA对食管癌细胞生长和化疗敏感性影响

目的观察慢病毒介导的shRNA沉默mcl-1基因对食管癌细胞生长作用以及化疗敏感性影响。方法利用已构建的携带mcl-1-shRNA的慢病毒载体lenti-mcl-1-shRNA感染食管癌细胞EC9706细胞系,应用RT-PCR和Western blot技术检测其对食管癌细胞mcl-1表达水平的影响;应用MTT和流式细胞技术检测其对食管癌细胞的生长作用、增殖和凋亡及化疗敏感性影响。结果感染慢病毒lenti-mcl-1-shRNA后,mcl-1 mRNA和蛋白表达水平明显下降;MTT结果显示,重组慢病毒lenti-mcl-1-shRNA可以有效抑制EC9706细胞的生长增殖,抑制率为50%,明显高于对照组(P<0.05)。流式细胞分析显示,mcl-1-shRNA可以诱导EC9706细胞凋亡,从而影响食管癌细胞的生长。另外与对照组相比,感染重组慢病毒lenti-mcl-1-shRNA后,可以明显增加顺铂对食管癌细胞的生长抑制率,提高药物敏感性(P<0.05)。结论慢病毒载体lenti-mcl-1-shRNA可有效抑制mcl-1在食管癌细胞中的表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞生长增殖,并增加食管癌细胞对顺铂的药物敏感性。     

顺铂通过p66Shc-线粒体信号通路诱导人肾小管上皮细胞凋亡

 目的：探讨p66Shc-线粒体信号通路在顺铂诱导的人肾小管上皮细胞凋亡中的作用。方法：体外培养人肾小管上皮细胞,Western blotting法检测顺铂对p66Shc及磷酸化p66Shc(Ser36)蛋白表达的影响,然后将细胞分为对照组、顺铂组及顺铂+p66ShcS36A（第36位Ser突变为Ala的p66Shc）组,用激光共聚焦显微镜观察p66Shc对顺铂诱导的细胞活性氧簇、线粒体活性氧簇及细胞凋亡的影响,Western blotting法检测线粒体凋亡信号通路相关蛋白的表达。结果：顺铂促进p66Shc蛋白磷酸化,对p66Shc蛋白表达无影响;顺铂诱导细胞凋亡,细胞及线粒体活性氧簇产生增加,细胞色素C释放,caspase-9表达增加,p66ShcS36A可以抑制顺铂诱导的细胞氧化损伤及凋亡。结论：顺铂通过p66Shc-线粒体信号通路诱导人肾小管上皮细胞凋亡。     

虎杖苷与顺铂联合增强卵巢癌SKOV3细胞的凋亡作用

目的考察虎杖苷和顺铂联合给药对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的作用机制。方法 SKOV3细胞分为虎杖苷和顺铂分别及联合给药组,采用MTT法检测对细胞增殖抑制的影响;流式细胞仪检测细胞的凋亡率,并观察细胞晚期凋亡(48h)的形态学变化;Western blot检测凋亡蛋白和线粒体通路相关蛋白的表达水平。结果 MTT结果显示SKOV3细胞在虎杖苷和顺铂联合给药后明显降低细胞存活率,且呈时间和浓度依赖性;单克隆形成实验结果显示虎杖苷与顺铂联合给药抑制细胞增殖的能力增强;AnnexinV-FITC单染检测细胞凋亡率显示,与顺铂给药组相比,联合给药组细胞凋亡率增加11.5%;Western blot检测结果表明联合给药组与顺铂单药给药组相比,凋亡蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-9的表达均增强;线粒体凋亡相关蛋白Bax升高,Bcl-2降低。结论虎杖苷和顺铂联用能增强顺铂对细胞增殖的抑制作用,促进细胞凋亡,初步阐明联合给药的抗癌机制是通过线粒体凋亡途径所介导。     

凋亡诱导因子介导TAp63γ诱导的人食管鳞癌细胞株EC9706细胞凋亡

目的探讨TAp63γ诱导的人食管鳞癌细胞株EC9706细胞凋亡的分子机制。方法用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测食管鳞癌EC9706细胞中凋亡诱导因子（AIF）和p63的表达;将质粒pcDNA3．1-TAp63γ转入EC9706细胞,流式细胞仪检测凋亡率,并用激光共聚焦显微镜和亚细胞器分离技术观察分析AIF的转位;采用RNA干扰技术下调AIF的蛋白表达水平,caspase广谱抑制剂zVAD．fmk预处理细胞,再用流式细胞仪分析EC9706细胞表达TAp63γ后凋亡率的变化。结果EC9706细胞中AIF表达且定位在细胞质中,p63基因的表达亚型是ANp63,TAp63γ不表达;在pcDNA3．1-TAp63γ转染组和pcDNA3．1-p53转染组的细胞质及细胞核蛋白中分别检测到AIF,pcDNA3．1转染组的胞核蛋白无AIF信号;pcDNA3．1转染组、pcDNA3．1-TAp63γ转染组、AIF—siRNA干扰后再转染pcDNA3．1-TAp63γ组、zVAD．fmk处理后再转染pcDNA3．1-TAp63γ组和AIF-siRNA干扰联合zVAD．fmk处理后再转染pcDNA3．1-TAp631组的凋亡率分别为1．37％、13．64％、4．52％、4．03％和1．91％。结论TAp63γ在诱导EC9706细胞凋亡的过程中,AIF从线粒体释放入胞质并转位到细胞核内;下调AIF的蛋白表达水平可降低TAp631诱导的细胞凋亡;TAp631诱导的细胞凋亡依赖于AIF和caspase。     

Expression of cystatin C and its effect on EC9706 cells in esophageal carcinoma

Objective: To investigate the expression of cystatin C gene and its effect on the proliferation, apoptosis and invasiveness of EC9706 cells in esophageal carcinoma. Methods: 56 cases of esophageal carcinoma were randomly collected from our hospital. Samples of human esophageal carcinomas and matched normal esophageal mucosal epithelium were selected by resection operation from these patients. Expression of cathepsin B and cystatin C in these specimens were determined by immunohistochemistry and qRT-PCR. Next, lentiviral vectors of over-expression and interference for cystatin C gene were constructed, and both were transfected into EC9706 cells, and then the levels of cystatin C mRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot. The effect of over and low-expressed cystatin C on the proliferation, apoptosis and invasiveness of esophageal carcinoma cells were detected by MTT assay, flow cytometry and Transwell assay. Results: Compared with normal esophageal epithelial tissues, mRNA and protein levels of cathepsin B and cystatin C in esophageal carcinoma tissues were significantly increased (P<0.05). Lentiviral vectors of over-expression and interference for cystatin C gene were successfully transfected into EC9706 cells. Over or low-expression cystatin C had no effect on EC9706 cells proliferation but had a reverse relationship with the apoptosis. However, cystatin C over-expression significantly decreased tumor invasiveness (P<0.05) while the invasiveness of EC9706 cells was significantly enhanced by RNAi-mediated abrogation of cystatin C gene expression (P<0.05). Conclusion: Over-expressed cystatin C could inhibit the invasiveness of esophageal carcinoma cells.     

CNTN-1促进人食管癌EC9706细胞侵袭和迁移

目的探讨接触蛋白-1(CNTN-1)在食管癌转移中的作用。方法 q PCR和Western blot检测食管癌细胞系EC9706中CNTN-1的表达;RNA干扰和CNTN-1过表达质粒转染调整EC9706细胞CNTN-1的表达,并将细胞分为空白对照组、scrambled siRNA组、CNTN-1 siRNA组、pcDNA3.1-vector组和pcDNA3.1-CNTN-1组;Brd U和Transwell实验分别检测EC9706细胞增殖、侵袭和迁移能力;qPCR和Western blot检测基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。结果 CNTN-1在食管癌细胞EC9706中mRNA和蛋白水平较与正常食管上皮细胞显著上调(P0.05);转染CNTN-1siRNA后,EC9706细胞CNTN-1表达水平显著降低(P0.05),细胞增殖、侵袭和迁移能力显著下降(P0.05),同时细胞中侵袭转移相关蛋白MMP-2和MMP-9表达明显下降(P0.05);CNTN-1过表达质粒转染细胞后,EC9706细胞内CNTN-1表达水平上调(P0.05),细胞增殖、迁移和侵袭能力显著升高,同时MMP-2和MMP-9表达明显升高(P0.05)。结论 CNTN-1可能通过调节MMP-2和MMP-9表达促进食管癌细胞的侵袭转移。     

食管癌细胞放射诱导前后化疗敏感性变化及相关机制研究

目的： 探讨食管癌细胞放射诱导前后对化疗药物敏感性及耐药基因ERCC1表达的变化，分析ERCC1的表达与化疗敏感性变化的关系。方法: 采用［60Co］-γ射线反复多次照射食管癌细胞株EC9706，建立放射抗拒食管癌细胞株EC9706-R。MTT法测定EC9706和EC9706-R对顺铂的IC₅₀,计算耐药指数。免疫细胞化学(SP)和RT-PCR法测定ERCC1蛋白和mRNA在2种细胞中的表达。结果: EC9706细胞对顺铂的IC50是(1.480±0.012) mg/L，EC9706-R细胞的IC₅₀是1.836±0.008 mg/L(P<0.05)，耐药指数为：1.240±0.015；ERCC1蛋白在2种细胞中染色强度指数分别为2.838±0.055和2.898±0.039，两者无统计学差异(P>0.05)。ERCC1在这2种细胞中mRNA表达的特异性基因条带与β-actin基因条带的密度比值分别为：1.168±0.068和1.143±0.089（P>0.05）。结论: 诱导建立的食管癌放射抗拒细胞较亲本细胞的化疗敏感性下降,而耐药基因ERCC1的表达水平不随细胞对放化疗敏感性的变化而变化。     

姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核磷蛋白的表达与定位变化

目的探讨核磷蛋白NPM在癌细胞诱导凋亡过程中在细胞内、细胞核基质上的定位与表达变化,以及NPM与凋亡调控相关蛋白的关系,探索其在凋亡调控中的作用。方法在姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡的基础上,以亚细胞蛋白质组学方法分析NPM在核基质中的存在与变化,并以免疫印迹法杂交实验进行确证;激光扫描共焦显微镜观察NPM在EC9706细胞凋亡过程中的定位与变化,以及NPM与Bax、Bcl-2等基因产物的共定位关系。结果 NPM存在于EC9706细胞核基质蛋白组分中,并在姜黄素处理后表达下调。NPM在EC9706细胞凋亡过程中发生显著的胞质-核之间的穿梭定位变化,并与Bax、Bcl-2等蛋白具有共定位关系,且共定位区域发生了变化。结论 NPM是一种核基质结合蛋白,在EC9706细胞凋亡中的表达与定位变化,及其与凋亡调控蛋白的共定位关系提示,它在EC9706细胞凋亡调控中具有重要作用。     

Expression of ECRG4 is associated with lower proliferative potential of esophageal cancer cells

We have shown that ECRG4 suppressed Fas‐induced apoptosis in Jurkat cells. ECRG4 mRNA expression was ubiquitously detected in normal adult human tissues, suggesting that ECRG4 plays a major role in human tissues. ECRG4 mRNA expression was down‐regulated in tumor cells. Expression of ECRG4 suppressed cell growth. We established an anti‐ECRG4 monoclonal antibody. Our immunohistochemical analysis demonstrated that ECRG4‐positive cells tended to be distributed in the region that was negative for Ki‐67 in esophageal squamous cell carcinoma tissues. There was a significant inverse correlation between ECRG4 expression and Ki‐67 labeling index in esophageal squamous cell carcinoma. This study provides the first functional evidence for an association of endogenous expression of ECRG4 with cell proliferation. ECRG4 is a candidate tumor suppressor gene that might be involved in the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma.     

食管癌细胞表面DR5的表达分布与细胞铺展状态的关系

目的：探讨食管癌鳞癌EC9706细胞系细胞表面DR5的表达分布与细胞铺展状态的关系。方法：免疫细胞化学技术分析食管癌EC9706细胞的DR5表达分布；流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5的表达及细胞的凋亡率。结果：DR5分布在食管癌EC9706细胞的细胞质和细胞膜表面，主要在细胞质，但在细胞核没有DR5分布，而且在悬浮的食管癌细胞表面DR5表达高于铺展者。悬浮的食管癌细胞对抗DR5功能性抗体诱导的细胞凋亡敏感性高于铺展者。结论：食管癌细胞表面DR5的表达与细胞铺展状态具有密切的关系，细胞铺展状态的变化直接影响细胞表面DR5的表达分布以及对抗DR5功能性抗体诱导的细胞凋亡敏感性。该研究结果对进一步探讨DR5表达分布的机制以及TRAIL和DR5的功能性抗体的抗肿瘤临床应用有一定的指导意义。