抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区VL与GFP融合蛋白的表达及生物活性测定

目的 :在大肠杆菌中表达抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区基因 (VL)与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合蛋白 ,并测定其生物学活性。方法 :应用基因工程技术 ,将EGFP基因克隆到载体pTO T7中构建原核表达载体。然后将MA18/7的VL基因按照读码框插入到无终止密码子TAA的EGFP基因的 5′末端 ,构建融合蛋白表达载体。通过ELISA和相对荧光强度测定在大肠杆菌中表达的融合蛋白的活性。结果 :构建了EGFP MA18/7 VL 表达载体。SDS PAGE表明 ,融合蛋白主要以包涵体的形式存在。荧光测定显示 ,融合蛋白保持了GFP的荧光性质。ELISA的结果表明 ,融合蛋白与重链可变区 (VH)片段结合成的Fv ,能特异性地识别HBVpre S1抗原。结论 :成功地获得具有良好生物学活性的融合蛋白 ,可用于进一步的研究。     

可溶性人干细胞因子与EGFP融合基因的构建及真核表达

目的　可溶性人干细胞因子 (SCF)膜外活性区与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)融合基因表达载体的构建及其表达。方法　应用基因工程技术构建重组载体 ,电穿孔转染CHO K1细胞株 ,荧光分光光度计检测上清液中融合蛋白的表达 ,流式细胞仪检测其活性。结果　融合基因在瞬时转染的真核细胞中获得表达 ,并分泌至上清 ,且SCF EGFP融合蛋白中分子标签EGFP未影响可溶性人SCF膜外活性区的结构及其生物学活性。结论　可溶性人干细胞因子与EGFP融合基因载体构建成功 ,表达的融合蛋白具有生物活性 ,为进一步研究SCF对造血干细胞的生物学作用奠定了基础。     

绿色荧光蛋白-去整合素融合蛋白的表达及其结合功能的研究

目的：构建绿色荧光蛋白（CFP）-去整合素（disintegrin）融合基因，表达并分析该重组蛋白的生物学活性。方法：利用HF-PCR扩增Ⅱ型蛇毒出血性金属蛋白酶agacutin基因的去整合素区，并与绿色荧光蛋白基因进行拼接；将GFP-去整合素融合基因克隆入表达载体pQE-30，IPTG诱导重组蛋白表达；流式细胞术（FCM）与荧光显微镜分析重组蛋白与细胞的结合能力。结果：GFP-去整合素融合蛋白的表达载体在大肠杆菌M15中得到有效表达，菌体呈绿色。表达的蛋白量占菌体总蛋白的38％左右，免疫印迹证实分子量约为39kD；FCM分析显示该重组蛋白可与表达整合素的乳腺癌细胞MDA-MB-231和内皮细胞EA．hy926特异结合，在荧光显微镜下可见与重组蛋白结合的细胞发出绿色荧光。结论：GFP-去整合素融合蛋白可与表达整合素的细胞结合，并保留了各自的生物学活性，可用作肿瘤与血管生成等研究的新的分子标记物。     

AR-GFP融合基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建由绿色荧光蛋白（GFP）标记的人醛糖还原酶（AR）融合基因真核表达载体并在HEK293细胞中表达。 方法:应用DNA重组技术构建AR与GFP的融合基因（AR-GFP），将AR-GFP插入pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体中，通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞，倒置荧光显微镜评价转染效率，Western blotting 技术检测AR基因在转染细胞中的整合及表达，分光光度法（UV法）测定AR表达活性，用公认的AR抑制剂（ARI）反证活性AR的存在。结果:荧光显微镜对转染细胞的观察及Western blotting 结果证实AR-GFP融合蛋白在HEK293细胞中表达，UV法测活、ARI抑制试验均未证实其生物学活性。 结论:转染的HEK293细胞可成功地表达AR-GFP融合蛋白，但不能成为ARI真核细胞筛选模型。     

S100A2基因cDNA克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的：克隆S100A2 cDNA、构建S100A2重组表达载体并在肝癌细胞QGY7701中进行表达。方法：应用RT-PCR和DNA重组技术构建绿色荧光蛋白（EGFP）-S100A2融合蛋白表达载体，经脂质体导入QGY7701细胞中进行表达。应用荧光显微镜直接观察EGFP-S100A2融合蛋白的表达情况，G418筛选阳性细胞克隆。结果：构建了带有EGFP的S100A2重组表达载体命名为EGFP-C2-A2，并在肝癌细胞QGY7701中获得了表达。荧光显微镜下可见EGFP-S100A2融合蛋白定位于胞浆及胞核，而pEGFP载体对照之EGFP只定位在胞浆中。结论：EGFP-S100A2融合蛋白能够在肝癌细胞QGY7701中获得表达，各自在细胞中的定位互不受影响，推断此融合蛋白具有各自的生物学活性。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

Hyper-IL-6融合基因的构建及在真核细胞中的表达

目的： 构建融合基因Hyper-IL-6并在真核细胞中进行表达.方法： 采用基因拼接（GeneSOEing）法将人类可溶性白细胞介素6受体和白细胞介素6的编码基因用一富含甘氨酸序列的接头经PCR扩增融合, 并定向克隆至pIRES2-EGFP, 构建与绿色荧光蛋白（GFP）共表达的融合重组质粒, 转染哺乳动物细胞, 通过绿色荧光蛋白、 RT-PCR和免疫组化检测Hyper-IL-6蛋白的表达.结果： PCR扩增出1 224 bp的Hyper-IL-6编码序列并成功构建重组质粒pIRES-HIL-6, 重组质粒转染真核细胞后经检测证实Hyper-IL-6能在真核细胞中表达.结论： 人类Hyper-IL-6重组表达质粒的成功构建与真核表达为以后对其进行活性分析和生物学功能的研究提供了基础.     

S100A2基因cDNA克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的克隆S100A2 cDNA、构建S100A2重组表达载体并在肝癌细胞QGY7701中进行表达. 方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建绿色荧光蛋白(EGFP)-S100A2融合蛋白表达载体,经脂质体导入QGY7701细胞中进行表达.应用荧光显微镜直接观察EGFP-S100A2融合蛋白的表达情况,G418筛选阳性细胞克隆. 结果构建了带有EGFP的S100A2重组表达载体命名为EGFP-C2-A2,并在肝癌细胞QGY7701中获得了表达.荧光显微镜下可见EGFP-S100A2融合蛋白定位于胞浆及胞核,而pEGFP载体对照之EGFP只定位在胞浆中. 结论 EGFP-S100A2融合蛋白能够在肝癌细胞QGY7701中获得表达,各自在细胞中的定位互不受影响,推断此融合蛋白具有各自的生物学活性.     

分泌型TAT蛋白转导结构域基因通用真核表达载体的构建及表达

目的：构建一个全新的分泌型TAT蛋白转导结构域基因哺乳动物细胞融合表达载体并对融合蛋白的表达进行分析。方法：依照编码TAT—PTD11肽及所引入的BamHⅠ酶识别序列和增强性绿色荧光蛋白N端7个氨基酸的碱基序列合成了3条引物，以egfp基因为模板通过依次3轮PCR扩增得到tat-egfp融合基因，该基因片段以sfiⅠ和HindⅢ双酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pSectagA，构建成重组载体pSecTAT-m-egfp，BamHⅠ单酶切后该载体自连，即得到可通用的真核表达载体pSecTAT—m，重组质粒psecTAT-m-egfp转染HEK293细胞，融合蛋白的表达用Western blot分析。结果：酶切及测序证实表达载体pSecTAT—m构建成功，Western blot表明TAT—EGFP融合蛋白在HEK293细胞中获得表达并分泌到细胞培养液中。结论：成功地构建了分泌型TAT蛋白转导结构域基因的哺乳动物细胞融合表达载体，为更充分发挥TAT蛋白转导结构域在蛋白质功能及疾病治疗研究中的应用打下了基础。     

增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与轮状病毒（RV）VP6基因融合表达载体,研究融合蛋白表达及在细胞中的分布。方法提取A组人RVTB-Chen株VP6基因,用PCR扩增VP6编码cDNA片段。将此基因片段与真核表达载体pEGFP-C1携带的EGFP融合;运用脂质体的方法,将获得的重组质粒转染到MA104细胞中,在荧光显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的分布情况。结果成功构建了融合表达质粒;转染细胞后,融合蛋白可在MA104细胞中表达且主要分布在胞质中。结论RVVP6可与EGFP融合表达,融合蛋白在细胞质中呈均匀的分布,与RV感染细胞中合成的VP6蛋白的分布有较大的差别。