应用套式聚合酶链反应诊断狂犬病

作者用一种简便、敏感、特异的聚合酶链反应(PCR),即套式PCR(NPCR)对狂犬病病毒进行检测。该法包括用硫氰酸胍、苯酚、氯仿从人及动物脑组织中提取狂犬病病毒RNA;逆转录;使用两对引物进行两步DNA扩增;检测扩增产物。 作者对206份犬脑样品进行检测,其中荧光抗体试验(FAT)及小鼠接种试验(MIT)阳性的95份样品检测结果均为阳性,110份阴性样品亦为阴性,1份FAT阴,陛而MIT阳性的样品,NPCR检测为阳性;所有NPCR及MIT阳性的96份样品中,经一步PCR扩增只有36份阳性。3例病人的脑组织样品经一步及两步PCR扩增后检测结果均为阳性,两份阴性对照样品NPCR检测均为     

重组酶介导扩增技术与传统聚合酶链反应技术在甲状腺癌DNA甲基化检测中的应用比较

目的 建立重组酶介导的核酸扩增(RAA)技术特异性检测DNA甲基化的新方法并与传统的DNA甲基化特异性PCR(MSP)方法进行比较.方法 选取OXTR基因作为目的基因,提取样品外周血基因组DNA,经亚硫酸氢盐修饰后分别以MSP和RAA技术进行特异性检测DNA甲基化实验.结果 2种技术皆能扩增出OXTR非甲基化条带,而RAA技术成功扩增OXTR甲基化条带.结论 RAA是一种新型的等温体外核酸扩增技术,实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增,可成为替代MSP乃至其他PCR实验的新方法.     

卡介菌多糖核酸对小鼠干扰素γ表达的影响

目的:鉴定卡介菌多糖核酸诱导小鼠产生干扰素γ的能力。方法:分别采用生理盐水、卡介菌多糖核酸和脂多糖处理Balb/c小鼠,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增编码小鼠干扰素γ(mIFNγ)cDNA,通过RT-PCR产物来评价卡介菌多糖核酸诱导mIFNγ表达的能力,并设β-actin为对照。结果:生理盐水组只扩增出β-actin条带,未扩增出mIFNγ cDNA,卡介菌多糖核酸组和脂多糖组的RT-PCR产物中均有mIFNγ和β-actin cDNA条带;与脂多糖组比较,卡介菌多糖核酸组的mIFNγ表达显著增强(P<0.01)。结论:卡介菌多糖核酸能有效诱导mIFNγ的表达。     

从血液中直接捕获丙型肝炎病毒RNA的快速检测法

已往报道检测丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)的标准方法,基本上是通过酚氯仿抽提、乙醇沉淀从血清中获得全部核酸,把HCV-RNA逆转录为cDNA后,经聚合酶链反应(PCR)扩增,用DNA印迹及核酸杂交法进行检测。但提取病毒核酸的操作繁琐,且有外源性核酸污染的危险。为解决这一问题,本文介绍了一种简单的从血清中直接捕获HCV-RNA的方法。作者设计了5个与HCV-RNA互补的生物素化寡核苷酸片段(LD40E、LD57、LD58、LD53和LD52)用以直接捕获血清中的HCV-RNA,并用生物素化的无关寡核苷酸BG1作对照。     

35例下生殖道病损的HPV基因芯片检测分析

目的比较基因芯片与聚合酶链反应(PcR)在人乳头瘤病毒(HPV)检测分型中的优缺点。方法抽提待检样品的核酸,扩增及荧光标记后与HPV检测及分型基因芯片杂交,用GMS418扫描仪对杂交后的芯片进行扫描检测;同时用PCR的方法对这些样品进行HPV检测。结果3例假性湿疣均无HPV检出,22例尖锐涅疣和6例宫颈癌组织HPV均为阳性,4例CINII-Ⅲ级中3例HPV阳性,1例阴性：基因芯片检测结果与PCR结果一致。结论HPV检测分型芯片是一种敏感高效的HPV检测分型方法。     

人真核表达慢病毒质粒载体plenti6/V5-D-TOPO(R)-T13RⅡ Dnglytk的构建及意义

目的:构建含有T13R Ⅱ DNglytk的慢病毒质粒载体plenti6/V5-D-TOPO(R)-TβR Ⅱ DNglytk,用含有TβR ⅡDNglytk质粒的慢病毒感染T淋巴细胞使其对转化生长因子-β(TGF-β)失敏感.恢复其对肿瘤的杀伤活性.方法:以原始质粒为模板,PCR扩增TβRⅡ DN和HSV-tk基因,运用重组PCR方法将2个基因连接起来,获得TβR Ⅱ DNglytk融合基因,再以此基因为模板,PCR扩增获得其对照基因TRANSglytk.应用Invitrogen公司提供的系统,通过TOPO技术将2个融合基因分别连接到慢病毒表达质粒,并经过测序验证.结果:完成慢病毒表达质粒载体TβR Ⅱ DNglytk的构建,经测序验证序列正确,可以用于相应慢病毒的生产.结论:运用重组PCR技术和TOPO技术成功构建了plenti6/V5-D-TOPO(R)-T13RⅡDNglytI[载体,为产生对TGF-β不敏感的人肿瘤特异性淋巴细胞,并用于肿瘤的免疫治疗提供了基础.     

核酸扩增测定和血浆制品

1994年11月23日,欧洲血浆分离协会(EPFA)和英国国立生物标准和控制研究所(NIBSC)在芬兰赫尔辛基组织召开了一次研讨会,会议旨在对核酸扩增测定在血浆制品生产过程中的应用提出科学的看法,会议重点讨论了聚合酶链反应(PCR)和其他扩增测定在检测血液病毒核酸中的价值。     

8675例淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和解脲支原体核酸PCR检测

我们对 86 75例泌尿生殖系统感染的尿道及阴道分泌物和慢性前列腺炎的前列腺液用 PCR方法检测淋病奈瑟菌 (NG)、沙眼衣原体 (CT)和解脲支原体 (U U)的核酸 ,结果如下。1　材料与方法1.1　研究对象 :1996年 3月至 1999年 8月来我院男性科门诊、妇产科门诊和泌尿外科门诊就诊的患有泌尿生殖系统感染的病人 ,其中男性 3870例 ,女性 480 5例 ,均为无选择的随机样品。1.2　样品采集 :用加有无菌的生理盐水有盖无菌塑料离心管 ,收集尿道炎与宫颈炎的阴道分泌物 ,作为上述三种病原体的PCR检测样品。1.3　 PCR检测 :将样品管离心 (15 0 0 0 r/…     

慢性呼吸道感染患者呼吸道分泌物分离奈瑟菌的cppB与pJD1基因检测

目的检测慢性呼吸道感染患者分离奈瑟菌属菌种的cppB、pJD1,探讨cppB与pJD1检测对奈瑟菌属菌种鉴定及奈瑟菌感染诊断的意义。方法用常规聚合酶链反应(PCR)和real-time PCR方法,分别检测慢性呼吸道感染患者呼吸道分离的209株不同菌种奈瑟菌cppB以及pJD1基因。结果分离菌种的43株可检出cppB(阳性率20.6%),29株对检测pJD1的淋球菌核酸扩增荧光检测试剂呈阳性反应(阳性率13.9%),其中4株的cppB及pJD1检测均为阳性反应(阳性率1.9%)。结论引起慢性呼吸道感染的奈瑟菌属许多菌种具有淋球菌隐蔽质粒cppB,可与检测pJD1的淋球菌核酸扩增荧光检测试剂呈阳性反应。     

新疆地区鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因研究

目的了解20株鲍曼不动杆菌(A.baumannii,AB)β-内酰胺酶基因存在状况。方法用PCR方法对20株AB菌的9种β-内酰胺酶基因进行检测。结果20株AB菌中blaTEM阳性13株(65%)、blaADC阳性12株(60%)、blaSHV阳性1株(5%),其余β-内酰胺酶基因均阴性;1株blaSHV测得序列经比对为blaSHV-36型;1株blaADC作全长基因测序,测得序列经比对与美国核酸库已登录的blaADC DNA序列均不同,为新亚型。结论该20株AB菌对β-内酰胺类抗生素耐药与产β-内酰胺酶密切相关。     

多重PCR扩增乳腺癌克隆性T细胞TCRβ链全长序列

目的 建立乳腺癌克隆性T细胞TCRβ链全长编码序列(CDS)的多重PCR扩增方法。方法 根据Gen Bank现有TCR序列设计扩增TCRβ链24个亚家族上游引物24条,下游引物2条。对Mg2+、d NTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化,确定最佳反应体系进行TCRβ链多重PCR扩增,构建重组质粒并酶切鉴定。结果 扩增出乳腺癌转移淋巴结中的TCRβ链全长编码序列并成功构建重组质粒,5例患者共获得24个阳性克隆。结论 建立的TCRβ链多重PCR扩增方法具有特异、快速、简便的特点,为研究乳腺癌克隆性T细胞的特点提供了帮助。     

SELEX技术筛选入rhTGF—βsRⅡ亲和核酸库方法的建立

目的建立SELEX技术筛选rhTGF-βsRⅡ单链DNA亲和核酸库的方法，为后续分离rhTGF-βsRⅡ的单一核酸适体奠定基础。方法体外构建了一个长度为108nt、含60个随机核苷酸序列的ssDNA随机库。将靶蛋白rhTGF-βsRⅡ预先吸附到固相栽体Phenyl-Agarose上，再与ssDNA随机库温育，洗脱未结合核酸片段，回收与rhTGF-βsRⅡ结合的ssDNA。行PCR扩增时，采用5’端生物素化的下游引物，使PCR产物偶联上生物素。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物。利用Immobilized Streptavidjrr-Agarose捕获dsDNA，0．15N的NaOH使双链变性，释放非生物素标记的ssDNA，回收后用于下一轮筛选。随着筛选的进行，严谨度不断增加。结果经过8轮筛选后，富集库对靶蛋白的亲和力从0.76％上升到17.18％。结论成功建立了SELEX技术筛选rhTGF-βsRⅡ亲和核酸库的方法。     

用PCR检测接种水痘疫苗的健康儿童的水痘-带状疱疹病毒DNA

作者用聚合酶链反应（PCR）及双套式PCR对20名接种水痘疫苗的健康儿童检测了水痘-带状疱疹病毒（VZV）的DNA,证明接种水痘疫苗后存在病毒血症。 用水痘疫苗（Oka株）皮下接种20名1～9岁无自然水痘史的健康儿童,每剂含1000空斑形成单位（PFU）。取接种前及接种后1和4周咽拭子及外周血单个核细胞（PBMC）样本作PCR,同时采集血清样本检测对VZV的体液免疫力。另取12例1～13岁急性水痘患儿的PBMC样本作为阳性对照。结果表明,两种PCR皆未在接种者咽拭子样本中检出VZV DNA,用普通PCR检测除1例阳性对照患儿的PBMC样本外,其余均未检出VZV DNA。双套式PCR是将普通PCR扩增30次的DNA再作30次扩增,使敏感性大为提高。应用双套式PCR检测,12例阳性对照     

用PCR检测精液中的HIV DNA和RNA

作者研究了用多聚酶链反应(PCR)检测人类免疫缺陷症病毒(HIV)感染者的精子、无细胞精液和无精于单核细胞(NSMC)中的HIV核酸的可能性及效果。把23例未经抗逆转录病毒治疗的HIV感染者的精液样品通过离心、分层得到无细胞精液、NSMC和精子。再用含二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液溶解精于细胞,用不含DTT的缓冲液溶解NSMC,然后再以酚-氯仿抽提,     

PCR结合洋地黄毒苷标记的RNA探针及酶联免疫测定法检测HTV-1前病毒DNA

聚合酶链反应(PCR)技术与核酸分子杂交技术相结合可用于临床检测极微量的1型人类免疫缺陷症病毒(HIV-1)DNA。使用同位素探针存在半衰期短、危险及费时等缺点,限制了PCR的广泛应用,因此作者建立了PCR、溶液杂交(SH)反应和酶联免疫测定(EIA)三者相结合的PCR-EIASH法用于临床检测HIV-1 DNA。首先作者合成两对引物,外引物SK145-SK39用于扩增HIV-1gag基因(905～1204碱基对),其中SK145的5′端用生物素标记。内引物N5和N6用于扩增这一片段内部935～1117位碱基片段。引物N5的5′端含有T7RNA聚合酶启动子序列。通过PCR,把利用内引物从HIV-1基因组中扩增得到的小片段放入含有洋地黄毒苷标记三磷酸尿苷(UTP)的T7聚合酶体外转录体系中,利用其上游的启动子序列,转录得到洋地黄毒苷标记的单链RNA作为     

用标准化套式PCR检测全血溶解产物中的HIV-1DNA

聚合酶链反应(PCR)法虽已广泛地用于血液中1型人类免疫缺陷症病毒(HIV-1)DNA的检测,但其灵敏度、特异性会因实验者的经验、反应试剂和使用的PCR仪不同而异。另外两个重要因素是,由于HIV-1病毒有高度变异性,设计的引物能否检测所有的HIV-1,直接影响PCR的灵敏度,另外常规的样品制备是用外周血单核细胞制成溶解产物,这样一个繁琐的过程,会影响扩增效率。为建立一种灵敏、特异、简便的常规方法,作者用改进的PCR技术,建立了基于套式PCR(AMPLICIS试验)后扩增产物的亲和捕获及γ计数的固相测定法,并试用于样品的检测和HIV-1 DNA含量的测定。 作者选择与设计的三套新引物分别位于HIV-1的gag及pol结构基因和tat调节基因,每套引物包括外引物和内引物,引导第一步及第二步PCR,检测全血溶解产物中的HIV-1 DNA,然后用固相亲和捕获及γ计数鉴定扩增产物。作者就PCR条件优化,引物的特异性、灵敏度、影响因素以及与一步     

一种新β-内酰胺酶亚型SHV-56的发现及其临床意义

目的 分析产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)鲍曼不动杆菌SHV型β-内酰胺酶(BLA)的编码基因并确定其亚型。方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增BLA编码基因片段，双脱氧链终止法测定核苷酸序列、确定亚型。结果 临床分离的鲍曼不动杆菌HZ29株产生SHV型BLA，其扩增片段含825个核苷酸，核苷酸及相应的氨基酸序列经GenBank查询无相同序列，为新发现的一种BLA亚型，其序列已以SHV-56名称在美国核酸数据库GenBank成功登录(GenBank注册号：AY352599)。结论 临床分离的鲍曼不动杆菌HZ29株所产SHV型BLA为一种新发现的BLA亚型。     

抗原捕获聚合酶链反应检测血清中乙型肝炎病毒DNA

近年来,聚合酶链反应技术(PCR)已被广泛应用于分子生物学、遗传学、病毒学等许多领域。核酸扩增前的样品处理也日益受到大家的重视。许多国内外学者报道了诸多关于乙型肝炎病毒(HBV)DNA快速提取的方法,但由于试剂来源不易或重复性欠佳,难以普遍推广。我们建立的抗原捕获聚合酶链反应技术(AC/PCR)检测血清中HBV-DNA,具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点。抗体包被好的管子可以长时间保存,整个检测过程在一天内就可以完成,所以尤其适合在临床上推广应用。     

用优化RT-PCR高度敏感地检测血液样品中的病毒RNA基因组

聚合酶链反应（PCR）是扩增小量 DNA和RNA的最有力的工具,并广泛应用于核酸研究领域。然而RNA很容易因RNA酶的污染而降解,并且,在进行PCR扩增之前.RNA必须用逆转录酶反转录成 DNA,因此,RNA检测的敏感性一般比DNA低两个数     

临床分离鲍曼不动杆菌产β-内酰胺酶的研究

目的:了解临床分离鲍曼不动杆菌多重耐药株产β-内酰胺酶的情况。方法:采用K-B纸片法和梯度琼脂平板法测定细菌敏感性;鲍曼不动杆菌产β-内酰胺酶用Nitrocefin定性后,以市售试剂盒抽提质粒和染色体,PCR法扩增β-内酰胺酶基因,并对扩增产物进行基因测序和同源性比较。结果:研究所用的12株鲍曼不动杆菌均产β-内酰胺酶,对头孢菌素类高度耐药,但对碳青霉烯类和加酶头孢菌素较敏感;其中6株细菌经PCR扩增和产物序列分析表明其质粒上携带有β-内酰胺酶AmpC基因。结论:质粒介导的AmpC酶是临床分离的鲍曼不动杆菌对头孢菌素类药物产生严重耐药性的主要因素。