来源于大鼠腹股沟皮下脂肪垫与附睾周围脂肪的间充质干细胞生物学特性的对比研究

目的:分离培养大鼠腹股沟皮下和附睾周围脂肪的间充质干细胞(ADMSC),研究两种不同来源的间充质千细胞的生物学特征.方法:分离提取Wistar大鼠腹股沟皮下和附睾周围脂肪中的ADMSC,进行体外培养.观察细胞形态,计算细胞的收获情况,MTT法检测细胞的生长增殖状态,应用流式细胞仪检测细胞表面标志CD44以及细胞周期.地塞米松、胰岛素定向诱导后,油红O染色检测细胞内的中性脂肪.结果:单位质量腹股沟皮下和附睾周围脂肪组织中获得的间充质干细胞数量存在差异,两处细胞形态均为条索样.不同的时间点两处细胞的贴壁率相似,并且有同向变化的趋势.两处细胞的增殖能力相当.两处细胞绝大多数处于G0/G1,无明显差异.两处细胞表面标记CD44均为阳性.两处细胞经成脂诱导后,胞浆中有脂滴形成,经油红O染色,脂滴呈鲜红色.结论:从不同部位提取的ADMSC仅在单位质量组织所获得干细胞数量上存在差异,即单位质量的附睾周围脂肪中获取的干细胞数多于腹股沟皮下脂肪垫中获取的干细胞数.两处细胞的其他生物学特性以及成脂分化能力没有明显差异.     

不同部位脂肪源性干细胞的生物学特性比较

背景：大鼠不同部位来源的脂肪源性干细胞在体外培养时的特性是否存在差异目前尚无定论。目的：比较同一只大鼠不同部位来源的脂肪源性干细胞在体外培养时的生长特性和成脂诱导分化能力的差异。方法：无菌操作下取F344大鼠腹股沟及腹腔大网膜脂肪组织各5mL,Ⅰ型胶原酶酶解法分离出脂肪源性干细胞,细胞计数后进行体外培养,观察其形态特征和生长状态,MTT法测定不同部位细胞的倍增时间。取不同部位来源的第2代脂肪源性干细胞进行成脂诱导,诱导14d进行油红O染色,观察不同部位来源的脂肪源性干细胞的成脂分化能力。结果与结论：在同一只大鼠内脏大网膜脂肪获得的脂肪源性干细胞数目为（281＋10）×10^7L^-1。,明显多于腹股沟皮下脂肪的（85＋5）×10^7L^-1。（P〈0．01）。从内脏大网膜脂肪与腹股沟皮下脂肪获得的脂肪源性干细胞分别于第5,6天进入指数增长期;第9,10天到达平台期;倍增时间为50h和60h左右。传代后的细胞生长分化活跃,呈成纤维细胞样,成脂诱导后,大网膜组织来源的脂肪源性干细胞的成脂诱导分化率明显高于腹股沟组织来源的脂肪源性干细胞（38．90±2．86）％,（35．30±3.29）％,P〈0．01]。可见同一只大鼠不同部位脂肪组织分离得到的脂肪源性干细胞数目不同,体外成脂诱导分化能力亦存在差异。     

第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定

背景:有文献证实以酶消化法可获得在脂肪组织间充质干细胞,传至第10代时细胞生长仍良好,但表面标志物表达下降. 目的:分离培养大鼠脂肪组织间充质干细胞,传代至第4代,检测免疫表型. 方法:从6只SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离培养脂肪组织间充质干细胞,以贴壁细胞扩增传代至第4代.相差显微镜下观察脂肪组织间充质干细胞的形态,并用流式细胞术鉴定脂肪组织间充质干细胞的表面标志物CD11b,CD29,CD45,CD49d,CD90 和 CD106的表达率.结果与结论:大鼠脂肪组织间充质干细胞呈现类似成纤维细胞样形态学特征,免疫表型分析显示CD29和CD90 呈阳性,而CD11b、CD45、CD49d和CD106呈阴性反应.结果提示通过这种酶消化法获得的SD大鼠的脂肪组织间充质干细胞,免疫表型分析显示符合间充质干细胞的特征.     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景:脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的:构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法:切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论:体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈"S"型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

大鼠腹股沟脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及活体标记

背景:脂肪间充质干细胞具有来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的特点,有望成为骨组织工程、细胞治疗等的种子细胞。目的:培养扩增大鼠脂肪源间充质干细胞,以活体标记并鉴定其分化潜能。方法:无菌条件下取大鼠双侧腹股沟脂肪,Ⅰ胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增。取第 3 代脂肪干细胞进行流式检测 HCAM、CD106、CD29、CD49D 和 CD34,生长曲线测定,吉姆萨染色,菲立磁标记,成脂诱导后油红 O 染色及成骨诱导后茜素红染色钙结节。结果与结论:细胞呈长梭形漩涡样生长,第 3 代细胞流式鉴定 CD29 阳性,CD34、HCAM、CD49d、CD106 低表达,生长曲线测定有对数生长期,平台期,菲立磁标记阳性率达 80%,并且在一些诱导剂下分化为脂肪细胞及成骨细胞。提示,来源于大鼠腹股沟脂肪分离获得的脂肪源干细胞易于培养和传代扩增,并可活体标记且在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

大鼠腹股沟脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及活体标记

背景：脂肪间充质干细胞具有来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的特点,有望成为骨组织工程、细胞治疗等的种子细胞。目的：培养扩增大鼠脂肪源间充质干细胞,以活体标记并鉴定其分化潜能。方法：无菌条件下取大鼠双侧腹股沟脂肪,Ⅰ胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增。取第 3 代脂肪干细胞进行流式检测 HCAM、CD106、CD29、CD49D 和 CD34,生长曲线测定,吉姆萨染色,菲立磁标记,成脂诱导后油红 O 染色及成骨诱导后茜素红染色钙结节。结果与结论：细胞呈长梭形漩涡样生长,第 3 代细胞流式鉴定 CD29 阳性,CD34、HCAM、CD49d、CD106 低表达,生长曲线测定有对数生长期,平台期,菲立磁标记阳性率达 80%,并且在一些诱导剂下分化为脂肪细胞及成骨细胞。提示,来源于大鼠腹股沟脂肪分离获得的脂肪源干细胞易于培养和传代扩增,并可活体标记且在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

不同品系大鼠皮下脂肪源干细胞诱导分化能力的比较

目的:对比SD大鼠和Wistar大鼠皮下脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外诱导分化能力,为ADSCs的进一步应用提供实验依据。方法:SD大鼠和Wistar大鼠各6只取腹股沟脂肪垫,培养扩增ADSCs,相差显微镜下观察两个品系来源的ADSCs的形态。用第4代细胞进行成骨和成脂诱导,分别用茜素红和油红O染色观察向成骨细胞分化后的矿化结节和向脂肪细胞分化后的脂质沉积。结果:两个品系来源的ADSCs在细胞形态上没有显著区别,都能进行成骨和成脂诱导分化。结论:SD大鼠和Wistar大鼠腹股沟脂肪垫来源的ADSCs诱导分化能力差异无显著性。     

不同种系鼠源骨髓间质干细胞的分离培养及成脂能力

背景：目前常用骨髓间质干细胞为鼠源细胞,然而就大鼠和小鼠来源骨髓间质干细胞在传代过程中的纯化程度,表面抗原的表达和分化能力的差异性仍少见报道。目的：分离、鉴定并纯化不同种系鼠源骨髓间质干细胞,比较其在成脂分化中的差异。方法：采用差速贴壁法分离SD大鼠及Balb/c小鼠骨髓间质干细胞,通过传代纯化,并观察骨髓间质干细胞在此过程中得纯化程度及增殖状况,流式细胞数鉴别两种骨髓间质干细胞表面抗原的表达,比较不同来源间质干细胞在成脂分化的差异。结果与结论：在SD大鼠骨髓间质干细胞分离和培养过程中,其增殖能力显著强于Balb/c小鼠骨髓间质干细胞（P〈0.05）。其半数增长期为36h,在第3代时即可见典型的漩涡状贴壁生长特性。经流式细胞检测,Balb/c小鼠及SD大鼠均为不表达造血干细胞标志CD34,再后续的各代检测中亦未见该细胞标志表达（〈5%）,CD29随着不断的传代纯化其表达数量不断的增加,其中SD大鼠在第3代时其表面标志的纯度及达到99%,但Balb/c小鼠各代CD29随着纯化上升程度并不甚明显,与该种细胞镜下存在大量类内皮细胞表现相符合。在成脂方面SD大鼠骨髓间质干细胞依旧表现出了较强的多能特新,出现脂滴的时间明显早于Balb/c小鼠,随传代次数的增加,两种原代细胞均出现了自发的成脂分化的现象,且SD大鼠的出现程度大于Balb/c小鼠。说明SD大鼠来源骨髓间质干细胞较易获得纯度较高且增殖旺盛的细胞源,在成脂方面的能力强于Balb/c小鼠。     

体外分离培养兔脂肪干细胞的生物学特性

目的:建立兔脂肪干细胞的体外分离培养方法,鉴定并分析其生物学特性。方法:实验于2005-06/2006-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。选用雌性新西兰大白兔,兔龄4个月,无菌取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫,贴壁法及Ⅰ型胶原酶法分离出兔脂肪干细胞,并进行体外培养,取5代以后的兔脂肪干细胞观察其形态特征,并绘制细胞生长曲线及倍增时间,同时进行细胞过氧化物酶、苏丹黑B、碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原化学染色;用流式细胞仪检测其细胞表面标志并进行细胞周期分析。结果:①兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态:原代及传代的兔脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长,生长分化活跃。②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间:传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈“S”形,群体倍增时间为22h。③兔脂肪干细胞的化学染色特点:兔脂肪干细胞的过氧化物酶、苏丹黑B染色呈阴性,而碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原染色呈阳性。④兔脂肪干细胞表面标志及细胞周期:流式细胞仪检测结果显示兔脂肪干细胞的表面标志物CD29,CD44,CD90,CD105,CD166表达阳性,而CD31,CD34,CD45和CD106表达阴性。细胞周期分析显示,G0/G1期占80.25%,G2/M期占6.03%,S期占13.72%。结论:本次实验所分离出来的兔脂肪干细胞在体外具有生长稳定,增殖较快的特点。     

犬脂肪间充质干细胞体外分离培养及其多向分化潜能

目的:为进一步分析脂肪间充质干细胞的生物学特性,建立犬脂肪间充质干细胞的体外分离培养方法,并对其表面标志和多向分化潜能进行鉴定。方法:实验于2006-09/2007-04在解放军第四军医大学组织工程中心完成。①实验方法:1岁龄家犬麻醉后,无菌条件下取犬腹股沟皮下脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化,离心弃上层脂肪及上清,沉淀用含体积分数为0.1胎牛血清的D/F12培养基制成单细胞悬液,按2×108L-1接种于培养瓶中,细胞长满80%时用胰酶消化传代。②实验评估:分别取第3,5,10代脂肪间充质干细胞,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化;MTT法检测细胞增殖活性;采用免疫细胞化学和体外诱导分化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志和多向分化潜能进行鉴定。结果:①细胞形态观察:原代培养1d多数贴壁细胞呈圆形;3d时贴壁细胞数量明显增加,大部分呈梭形、三角形;6d后细胞呈团簇状生长,形成集落;9～10d后细胞融合超过80%。传代后2～4h开始贴壁,经过较短的潜伏期后开始增殖,3d即可长满培养瓶底壁。②细胞增殖活性:培养的细胞分裂增殖能力强,无明显的生长滞缓期,第3天进入对数生长期,第7天达到生长峰值,第8天后进入平台期。第3,5,10代细胞传代接种后的潜伏期、对数生长期、平台期无明显差异,传10代后细胞无明显的衰老征象。③细胞表面分子标志的鉴定:第3代脂肪间充质干细胞CD29,CD44均呈阳性表达。④脂肪间充质干细胞的多向分化潜能:向脂肪细胞诱导第6天胞质中出现透亮的小脂滴,油红染色呈阳性;向神经细胞预诱导24h后,细胞由梭形变为栅栏样,正式诱导0.5h后细胞呈双极或多极,3h后细胞形态不再发生变化,神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性;向成骨细胞诱导第21天可见钙化结节。结论:体外分离培养的犬脂肪间充质干细胞生长稳定、增殖较快,存在脂肪组织来源干细胞的相关标志分子CD29及CD44,诱导后能向脂肪细胞、神经细胞和成骨细胞分化。