树突状细胞疫苗对人肺腺癌GLC-82细胞体外杀伤作用的实验观察

目的 通过建立负载人肺腺癌细胞株GLC-82可溶性抗原的树突状细胞(DC)疫苗,探讨应用DC疫苗的致敏特异性杀伤性T细胞(CTL)体外杀瘤细胞的可行性和实验条件,为后期l临床应用提供实验依据.方法 通过用定量摩尔氯化钾提取法获得人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽(TSA),从人外周血单核细胞(PBMC)中用GM-CSF、白细胞介素-4和肿瘤坏死因子-α体外诱导扩增并鉴定获取DC,构建DC疫苗;利用DC疫苗刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖,诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL的可行性及MTT法检测该CTL对GLC-82、肺癌CALU-6和人红白血病K 562细胞的体外杀伤效应.结果 人PBMC体外经7d诱导出的DC,经形态学、免疫组化证实具有典型的树突状细胞特性;负载GLC-82抗原的DC疫苗能有效诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL,最适浓度为1:10;诱导活化的CTL对靶细胞的杀伤活性明显高于未经肿瘤抗原致敏的组.结论 诱导培养人外周血PBMC中的Mo可获取大量DC,诱导出的DC功能较强,适宜临床应用;DC疫苗能强烈刺激初始型同种异体T淋巴细胞增殖产生CD 8+表达增加的CTL;激活的CTL对肺癌靶细胞发挥高效而特异的细胞毒效应,对非肺组织瘤靶细胞也具有非特异性杀伤效应.     

负载EB病毒潜伏膜蛋白基因的树突状细胞疫苗的体内抗肿瘤免疫作用

目的 观察负载EB病毒潜伏膜蛋白(EBV-LMP2)基因的树突状细胞(DC)疫苗体内激活的细胞毒T细胞(CTLs),在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内对人鼻咽癌(NPC)细胞株CNE-2的免疫保护作用.方法 人外周血来源的单核细胞(PBMC)经细胞因子扩增培养为成熟DC,rAd-EBV-LMP2重组腺病毒转染DC制备疫苗,对疫苗进行致瘤性检测;采用人外周血T细胞悬液腹腔注射建立人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠(hu-PBL-SCID)模型,随机分为4组:对照组、T细胞组、未转染DC组、LMP2-DC组.末次免疫7d后,接种CNE-2细胞,观察小鼠成瘤率、成瘤潜伏期、肿瘤体积及重量;定期检测小鼠血清中人IgG水平;测定小鼠脾淋巴细胞的特异性细胞毒淋巴细胞(CTL)活性.结果 rAd-EBV-LMP2-DC疫苗接种于小鼠体内未见肿瘤形成,脾、肺、肝和肾等器官未出现肿瘤病变;小鼠血清均检测出人IgG,hu-PBL-SCID嵌合模型重建成功;LMP2-DC组肿瘤的潜伏期明显延长,肿瘤生长速度、体积及重量显著减小(P＜0.01),且LMP2-DC组小鼠脾淋巴细胞显示出对肿瘤细胞强大的杀伤活性(P＜0.01).结论 EBV-LMP2-DC疫苗能在hu-PBL-SCID小鼠体内诱导产生强大的CTL反应,保护小鼠免受肿瘤细胞的攻击,对肿瘤细胞具有有效的免疫保护作用.     

人树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫

目的 探讨人树突状细胞(DC)融合肝癌细胞(HCC)体外诱导T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的作用.方法 应用人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(rhIL-4)对人外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HerG2,MTT法测定融合细胞(HerG2/DC)刺激T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性实验检测HerG2/DC诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对HerG2的特异性杀伤作用.结果 融合细胞HerG2/DC刺激T淋巴细胞增值能力明显提高,HerG2/DC活化的CTL对HerG2具有明显的特异性杀伤作用.结论 人树突状细胞融合肝癌细胞可有效诱导T淋巴细胞产生特异性的抗肝癌肿瘤免疫.     

人树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫

目的探讨人树突状细胞（DC）融合肝癌细胞（HCC）体外诱导T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的作用。方法应用人重组粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素4（rhIL-4）对人外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HerG2,MTT法测定融合细胞（HerG2／DC）刺激T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性实验检测HerG2／DC诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对HerG2的特异性杀伤作用。结果融合细胞HerG2／DC刺激T淋巴细胞增值能力明显提高,HerG2／DC活化的CTL对HerG2具有明显的特异性杀伤作用。结论人树突状细胞融合肝癌细胞可有效诱导T淋巴细胞产生特异性的抗肝癌肿瘤免疫。     

灵芝多糖对体外树突状细胞诱导细胞毒性T-淋巴细胞的调节作用(英文)

目的:研究灵芝多糖(Gl-PS)在抗原提呈阶段对体外培养树突状细胞(DC)诱导特异性细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)功能的调节及其机制。方法:体外培养小鼠骨髓来源DC经P815肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏,并与不同浓度Gl-PS(0.8,3.2,或12.8 mg/L)共培养。成熟DC与脾淋巴细胞共培养诱导P815特异性CTL生成。第5天收集各组悬浮细胞及培养上清,采用乳酸脱氢酶法比较CTL特异性杀伤活性;RT-PCR法测定T扰素γ(IFNγ)及颗粒酶B mRNA在CTL的表达;ELISA或Western blot法检测IFNγ或颗粒酶B蛋白的表达。结果:3种浓度的Gl-PS均可增高培养上清中释放的LDH活性(P<0.01);增加CTL表达IFN7及颗粒酶B mRNA(IFNγ:Gl-PS 12.8 mg/L组与RPMI-1640组,P<0.05;颗粒酶B:P<0.01);促进CTL培养上清中IFNγ蛋白生成(P<0.05)以及CTL表达颗粒酶B蛋白(Gl-PS 12.8 mg/L组与RPMI-1640组,P<0.05)。结论:Gl-PS可在抗原提呈阶段促进P815肿瘤冻融抗原冲击致敏DC所诱导的特异性CTL的杀伤活性,其机制可能是通过IFNγ及颗粒酶B途径的调节。     

基因修饰的树突状细胞体外免疫功能的初步研究

目的 制备转染乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因、人外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)疫苗,观察HBcAg的表达效率,检测其在体外诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)对HepG2.2.15细胞的杀伤效应.方法 体外诱导并培养DC;将HBcAg基因导入...     

FasL基因修饰骨髓树突状细胞诱导同种异体反应性T淋巴细胞凋亡

目的 探讨FasL基因转染骨髓来源树突状细胞(DC)诱导同种效应T淋巴细胞凋亡及抗原特异性T淋巴细胞的低反应性的机制.方法 采用腺病毒载体将FasL基因转染骨髓来源树突状细胞用流式细胞术(FCM)检测FasL基因的表达及同种效应T淋巴细胞的凋亡率,通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原特异性T淋巴细胞的低反应性.结果 FasL基因通过腺病毒载体转染骨髓来源树突状细胞可以获得有效表达,FasL-DC组的凋亡率为83.19%,明显高于对照组(LacZ-DC组、Day-7-DC组)的11.57%、7.93%(P＜0.05),FasL-DC组与对照组相比显著地抑制了淋巴细胞的增埴(P＜0.05),但在与无关第三者(C3H)共培养时,T淋巴细胞仍然显示强的增埴能力(P＞0.05).结论 FasL基因转染DC能够诱导同种反应性T淋巴细胞凋亡,产生抗原特异性T淋巴细胞的低反应性.     

致敏树突状细胞疫苗抗小鼠乳腺癌的实验研究

目的研究以EMT6乳腺癌细胞致敏的树突状细胞(DC)疫苗的抗肿瘤作用。方法无菌取小鼠骨髓细胞,在体外培养条件下经细胞因子诱导为DC,用EMT6肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏DC,检测经DC免疫产生的细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外杀伤肿瘤细胞的活性。建立EMT6荷瘤小鼠模型,随机分为实验组、实验对照组和空白对照组,于肿瘤接种后第7、14天给予相应DC疫苗治疗,观察致敏DC免疫对小鼠乳腺肿瘤模型的治疗作用。结果致敏DC诱导生成的特异性CTL在体外对肿瘤细胞可产生杀伤作用,与PBS对照组比较,差异有显著性(P<0.05);经致敏DC注射免疫后,小鼠移植瘤得到抑制,与PBS对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。结论以EMT6乳腺癌细胞致敏的树突状细胞(DC)疫苗在体外和小鼠体内均显示了抗肿瘤作用。     

脐带血与外周血来源树突细胞体外刺激特异抗白血病T细胞免疫应答

目的：比较脐血（CB）及外周血（PB）单个核细胞（MNC）体外诱导生成树突状细胞（DC）的产量;并将此DC负载白血病抗原,检测两者诱导的特异性细胞毒T细胞（CTL）对白血病细胞的杀伤活性。方法：取CB及健康成人PB各8份,以淋巴细胞分离液分离获得MNCs,培养体系中加入重组人粒单核细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）,重组人白细胞介素4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）,并在培养第5天,加入HL-60细胞经反复冻融提取的抗原,致敏DC。培养过程中,观察树突状细胞形态,流式细胞仪（FCM）检测表型。培养第12天收获成熟DC,CB组分别与8例PB来源T淋巴细胞共培养;PB组与自体T淋巴细胞共培养,诱导产生白血病特异性CTL,乳酸脱氢酶法（LDH法）测定溶靶细胞活性。结果：（1）CB与PB来源DC均表现出成熟DC典型形态和免疫表型特征,2组DC相关分化抗原CD1a、CD83、CD86、CD80和人类白细胞相关抗原DR（HLA-DR）的表达较培养前增高,2组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。（2）CB组DC产量高于PB组,差异有统计学意义（P〈0.01）。（3）以白血病抗原冲击的DC所刺激的T淋巴细胞对白血病靶细胞显示出明显的杀伤活性,按照各效靶比进行两者的比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：利用细胞因子体外诱导CB及PB来源MNCs均能产生大量成熟DC,且功能相同;前者DC产量更高,来源丰富,可能成为急性白血病免疫治疗中DC的丰富来源。     

GM-CSF分泌型肝癌疫苗对荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的影响

目的 研究粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌型肝癌疫苗对小鼠移植性肝癌H22的免疫调节效应.方法 将构建完成的GM-CSF分泌型H22肝癌瘤苗免疫ICR小鼠(肝癌组),同时设立无GM-CSF基因修饰H22肝癌瘤苗组及PBs对照组;应用流式细胞术检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群,CCK-8法检测脾细胞细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果 肝癌组免疫小鼠外周血中CD8+T的含量高于瘤苗组及对照组(P<0.01);肝癌组CTL杀伤活性亦远高于其他两组(P<0.01).结论 GM-CSF分泌型肝癌细胞疫苗可抑制肿瘤细胞生长,并且诱导自体T细胞向CTL方向增殖分化CTL的增殖是该瘤苗引起特异性抗瘤免疫的基础,而GM-CSF的分泌则极大的增强了该瘤苗的免疫效果,此免疫效果主要通过直接活化CD8+CTL细胞产生.     

肌肉免疫DC-EBV-LMP2诱导免疫应答的研究

目的探讨肌肉免疫DC-EBV-LMP2诱导的免疫效果。方法从BALB/C小鼠分离骨髓细胞,诱导培养获得小鼠DC,以100 MOI的rAd-LMP2感染获得DC-EBV-LMP2,继续培养48h,诱导DC-EBV-LMP2成熟。用免疫酶法确定LMP2在DC中表达。0,2,4周,以2×105个DC-EBV-LMP2/只免疫BALB/C小鼠,于第5,8周分别LMP2特异性水平和T细胞亚群的变化。结果结果显示,肌肉免疫DC-EBV-LMP2可诱导BALB/C鼠LMP2特异性免疫应答,且第5周强于第8周。CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值在第5周高于对照组,而第8周低于对照组。结论 DC-EBV-LMP2肌肉免疫BALB/C鼠可诱导LMP2特异性CTL。     

树突状细胞介导的CTL在裸鼠体内外抑制白血病细胞生长的研究

目的研究白血病细胞可溶性蛋白抗原（SPA）致敏树突状细胞（DC）介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应在裸鼠体内、外抑制白血病细胞生长的效应,为白血病DC免疫治疗提供理论依据。方法利用人骨髓单个核细胞（MNC）体外培养DC,经形态、表型及功能综合鉴定。用纳米粒包裹白血病细胞SPA并致敏DC,在体外诱导出特异性CTL,用MTT法测定其活性。另分别将HL-60细胞与淋巴细胞（LC）或与CTL同时注入裸鼠体内,通过肿瘤体积、成瘤时间、肿瘤抑制率等对比各组抑制肿瘤生长的效果。结果（1）培养的DC具有DC的形态特征并高表达CD1a、CD83。（2）MTT法测定各组CTL活性,发现A1组较A2组和A3组、B1组较B2组和B3组有明显差异（均P〈0.05）。A3组及B3组CTL活性最高,A2组及B2组活性次之。（3）在裸鼠体内实验中,1组与2组、3组的肿瘤体积及成瘤天数比较均有明显统计学差异（P〈0.05）,而2组与3组比较却无显著性差异（P〉0.05）;2组与3组肿瘤抑制率分别为（50.70±13.74）%和（52.29±13.68）%。结论在体外实验用白血病细胞SPA及纳米粒包裹的SPA致敏DC,均能可介导较强的CTL作用,且纳米粒包裹SPA组的CTL活性更高。用白血病细胞SPA及纳米粒包裹的SPA致敏的DC在裸鼠体内同样可诱导出较强的CTL作用,表现为肿瘤体积明显小于对照组,成瘤天数也明显晚于对照组,但纳米粒包裹SPA致敏DC组在体内试验中未显示出更强的抑瘤活性。通过DC介导特异性的CTL可有效的抑制白血病细胞,是一种有良好临床应用前景的细胞免疫治疗方法。     

CD44v6修饰DC融合瘤苗抗胰腺癌作用的研究

目的：探讨CD44v6修饰树突状细胞（DC）融合瘤苗抗胰腺癌的作用,为肿瘤免疫治疗提供实验依据及理论基础。方法：（1）取小鼠骨髓细胞在细胞因子GM—CSF、IL-4、TNF—α的诱导下体外大量扩增DC细胞;（2）在PEG的作用下．进行DC和小鼠胰腺癌细胞（TD2）的融合,并利用HAT／HT系统筛选出纯净融合细胞株;（3）Lipofectamine 2000的介导下,将pBud—CD44v6转染到肿瘤融合细胞中表达;（4）荷瘤小鼠接种融合瘤苗,测量肿瘤大小。结果：成功构建了CD44v6修饰的D/TD2融合瘤苗：免疫组肿瘤体积明显小于对照组。结论 小鼠骨髓来源的DC在PEG作用下成功与TD2细胞融合,同时以CD44v6加以修饰,且融合细胞可有效诱导T淋巴细胞产生强大抗胰腺癌作用。     

CD_(44)v_6修饰DC融合瘤苗体外抗结肠癌作用的研究

目的小鼠提取的树突状细胞(DC)和小鼠结肠癌细胞CT26.WT共培养、融合,CD44v6基因来修饰融合细胞,研究CD44v6修饰DC融合瘤苗体外抗结肠癌的作用机制,为肿瘤预防及免疫治疗提供实验依据。方法①在聚乙二醇的作用下,DC细胞和CT26.WT细胞共培养、融合,利用HAT/HT筛选系统筛选出纯净DC融合细胞。在脂质体的作用下,将pBud-CD44v6转染到DC融合细胞中表达;②体外实验观察DC融合瘤苗对小鼠结肠癌细胞的杀灭作用。结果构建了基因CD44v6修饰的DC/CT26.WT肿瘤融合疫苗;实验组细胞的淋巴细胞毒(CTL)活性明显高于对照组。结论 CD44v6修饰的DC融合瘤苗可有效诱导T淋巴细胞产生强大抗结肠癌作用。     

不同抗原致敏树突状细胞对荷瘤大鼠经射频消融后免疫机能的影响

目的本研究在大鼠Walker256实体瘤射频消融术（RFA）后应用不同肿瘤抗原致敏的DC瘤苗,探讨其对大鼠抗肿瘤免疫的不同影响。方法38只荷Walker256实体瘤SD大鼠随机分成3组：对照组行RFA治疗,实验组1行RFA＋冻融抗原致敏DC治疗,实验组2行RFA＋热休克冻融抗原致敏DC治疗。治疗前及治疗后第4天分别测量各组大鼠外周血中CD4^＋T淋巴细胞、CD8^＋T淋巴细胞及CD4^＋/CD8^＋比值,记录大鼠的荷瘤生存期。结果治疗后各组荷瘤大鼠外周血中CD8^＋T细胞均呈下降改变,其中,下降的程度为实验组2〉实验组1〉对照组（P〈0.05）;CD4^＋/CD8^＋比值的变化,实验组2的升高与其他两组相比差异有统计学意义（P〈0.05）;实验组1的升高与对照组比差异无统计学意义（P〉0.05）。荷瘤生存期：实验组2〉实验组1〉对照组（P〈0.05）。结论在RFA后应用不同抗原致敏的DC可不同地程度改善大鼠的抗肿瘤免疫,冻融热休克抗原致敏DC较未热休克冻融抗原致敏DC能更有效地激发荷瘤大鼠的抗肿瘤免疫机能。     

CD44v5修饰DC融合瘤苗体内抗胃癌作用的实验研究

目的将小鼠骨髓来源的DC细胞和小鼠胃癌细胞MFC进行融合,同时以CIM4v5进行修饰,研究CD44v5修饰DC融合瘤苗抗肿瘤作用及其作用机制,为肿瘤免疫治疗提供实验依据及理论基础。方法①在PEG的作用下,DC细胞和MFC细胞进行融合,利用HAT／HT系统筛选出纯净融合细胞株。在Lipofectamine 2000的介导下,将pUC19-CD44v5转染到肿瘤融合细胞中表达;②荷瘤小鼠接种融合瘤苗,观测小鼠的生存期及种植瘤组织病理形态学变化情况。结果免疫组小鼠生存期延长,种植瘤组织病理形态明显改变。结论CD44v5修饰的DC融合细胞可有效诱导T淋巴细胞产生强大抗胃癌作用。     

树突状细胞为基础的胰腺癌与黑素瘤疫苗

基于最近的动物实验所获得的线索,本研究开展了一系列新的临床实验以评估针对黑素瘤和胰腺癌的树突状细胞(DC)疫苗的改进潜力。第一种新策略运用了一种强大的趋化因子(即次级淋巴组织趋化因子,SLC/CCL-21),既可在接种肿瘤负载的DC疫苗的位点产生功能性淋巴结样结构,又可极大地提高疫苗在动物肿瘤模型中的有效性。应用这种策略,本研究小组正在着手在黑素瘤患者中开展一项临床试验,旨在创造出有功能的、异位的、淋巴结状结构,以增强宿主的抗肿瘤免疫能力。第二种策略在胰腺癌患者中进行,包含一种基因治疗和免疫治疗,联合了辐射(用以诱导肿瘤凋亡/坏死)后局部给予肿瘤坏死因子α基因载体及肿瘤内给予单核细胞源性的DCs(用以从正在死亡的肿瘤细胞中提取并呈递抗原,进而引发强有力的、系统性的抗肿瘤免疫能力)。     

Dendritic cell-tumor coculturing vaccine can induce antitumor immunity through both NK and CTL interaction

Immunization of dendritic cells (DC) pulsed with tumor antigen can activate tumor-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) that are responsible for protection and regression. We show here that immunization with bone marrow-derived DC cocultured with tumor cells can induce a protective immunity against challenges to viable tumor cells. In this study, we further investigated the mechanism by which the antitumor activity was induced. Immunization of mice with DC cocultured with murine colon carcinoma. CT-26 cells, augmented CTL activity against the tumor cells. Concomitantly, an increase in natural killer (NK) cell activity was also detected in the same mice. When DC were fixed with paraformaldehyde prior to coculturing with tumor cells, most of the CTL and NK cell activity diminished, indicating that DC are involved in the process of presenting the tumor antigen(s) to CTL. NK cell depletion in vivo produced markedly low tumor-specific CTL activity responsible for tumor prevention. In addition, RT-PCR analysis confirmed the high expression of INF-gamma mRNA in splenocytes after vaccination with DC cocultured with tumors, but low expression in splenocytes from NK-depleted mice. Most importantly, the tumor protective effect rendered to DC by the coculturing with CT-26 cells was not observed in NK-depleted mice, which suggests that DC can induce an antitumor immune response by enhancing NK cell-dependent CTL activation. Collectively, our results indicate that NK cells are required during the priming of cytotoxic T-cell response by DC-based tumor vaccine and seem to delineate a mechanism by which DC vaccine can provide the desired immunity.     

脐血浆培养的脐血树突状细胞对胃癌细胞的特异杀伤作用

目的尝试用脐血浆代替胎牛血清培养脐血树突状细胞（DCs）,并使之负载胃癌抗原,观察其对胃癌细胞的特异杀伤作用。方法分离脐血单个核细胞（CBMCs）并在含10％同源脐血浆的培养体系中诱导培养,部分细胞加入胃癌冻融抗原冲击。流式细胞仪检测细胞表面抗原CD1a和CD83表达,MTT法检测DCs体外刺激淋巴细胞增殖活性,LDH法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）对胃癌及肝癌细胞的细胞毒作用。结果CBMCs能分化为表型正常的未成熟DCs,并进而吞噬胃癌细胞冻融抗原成熟,刺激淋巴细胞增殖并诱导对胃癌细胞株特异的CTLs毒性。结论脐血浆培养的脐血DCs能有效捕获胃癌冻融抗原,激发针对胃癌细胞的特异杀伤效应。本实验采用的DCs制备方法具有方法简单、成本较低、瘤苗制备时间较短等优点。