恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列，比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因，并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后，用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp，编码442个氨基酸。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因；序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

恶性疟原虫HRP-Ⅲ基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株HRP-I基因序列,比较FCC1/HN株与国外分离株HRP-I基因序列的差异.方法根据HRP-Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增HRP-I基因.通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP-I.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用分子生物学软件进行不同分离株HRP-Ⅲ基因序列的同源性比较.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株HRP-I基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP-Ⅲ重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因全长802bp,包含一个内含子,编码224个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的Itg2、FC27及IMTM22株HRP-Ⅲ基因序列有较高的同源性.结论成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因.序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的HRP-Ⅲ基因序列有高度的同源性.     

恶性疟原虫HRP—Ⅲ基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株HRP－Ⅲ基因序列,比较FCC1／HN株与国外分离株HRP－Ⅲ基因序列的差异。方法 根据HRP－Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增HRP－Ⅲ基因。通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP－Ⅲ。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件进行不同分离株HRP－Ⅲ基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP－Ⅲ重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因全长802bp包含一个内含子,编码224个氨基酸,序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的Itg2,FC27及IMTM22株HRP－Ⅲ基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因。序列测定及同源性分离表明,FCC1／HN株与其它分离株的HRP－Ⅲ基因序列有高度的同源性。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的　克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)侧翼核酸内切酶 1(FEN 1)基因序列,比较 FCC1/HN株与国外分离株FEN 1基因序列的差异。　方法　根据 FEN 1 基因已知序列设计合成 1 对引物,应用 PCR技术从 FCC1/HN株基因组DNA中扩增出FEN 1基因,构建重组质粒PMD18 T FEN 1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN 1基因序列的同源性比较。　结果　PCR扩增得到特异的 FCC1/HN株FEN 1基因序列,基因全长1 947 bp,A+T含量为56%,G+C含量为44%。酶切鉴定获得了正确的PMD18 T FEN 1重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN 1基因序列有较高的同源性。结论　成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株FEN 1基因。序列测定及同源性分析表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外已报道各株的FEN 1基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCCl／HN)侧翼核酸内切酶-1(FEN-1)基因序列，比较FCC1／HN株与国外分离株FEN-1基因序列的差异。方法 根据FEN-1基因已知序列设计合成1对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出FEN-1基因，构建重组质粒PMD18-T-FEN-1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN-1基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株FEN-1基因序列，基因全长1947bp，A T含量为56％，G C含量为44％。酶切鉴定获得了正确的PMD18-T-FEN-1重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN-1基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株FEN-1基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外已报道各株的FEN-1基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫FCC1/HN株RESA基因克隆及序列分析

[目的 ]测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)环状体感染红细胞表面抗原 (RESA)基因 3′端部分基因序列 ,比较FCC1/HN与国外分离株RESA序列的差异。 [方法 ]应用PCR技术扩增RESA基因 3′端部分序列 ,将其克隆入pMD18 T载体。阳性重组克隆经酶切及PCR鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定 ,并用分子生物学软件进行基因结构和同源性分析。 [结果 ]用PCR成功扩增出约 846bp的RESA基因特定片段 ,阳性克隆经酶切及PCR扩增确定。基因序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外FC2 7,PaloAlto ,NF7株RESA基因序列有不同程度的差异。 [结论 ]确定了恶性疟原虫FCC1/HN株RESA基因 3′端序列。同源性分析表明 ,FCC1/HN株RESA序列与其他分离株存在一定差异     

恶性疟原虫ABRA基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株ABRA基因真核表达重组质粒pcDNA3-ABRA;测定ABRA基因序列,并了解FCC1／HN株与其它分离株ABRA序列的差异。方法 根据ABRA基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1／HN株基因组的DNA中扩增ABRA基因,将ABRA基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用切,PCR扩增鉴定筛选到的重 质粒阳性克隆。以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定ABRA基因序列,应用软件辅助分析ABRA序列及进行同生比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株ABRA基因;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-ABRA重组质粒。测序表明,FCC1／HN株ABRA基因大小为2220bp,编码739个氨基酸。恶性疟原虫FCC1／HN株与Camp,3D7,FC27株ABRA基因编码氨基酸序列主要在C－端存在少量不同;FCR3株与以上4株ABRA基因编码氨基酸序列相比,只有少量的氨基酸替换。结论 从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中获取ABRA基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-ABRA,并测定了FCC1／HN株ABRA基因的序列;FCC1／HN株与其它分离株ABRA基因有很高的同源性。     

恶性疟原虫FCC1／HN株Pf332基因的克隆和测序

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1/HN）株红细胞膜相关巨大蛋白（Pf332）部分基因的真核表达载体;并测定Pf332基因序列,了解FCC1/HN株与3D7、Palo Alto株Pf332基因序列的差异。方法 根据已知Pf332基因序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因片段;将Pf332部分基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞;阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增鉴定,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件辅助分析Pf332序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-Pf332重组质粒。测序表明,获得的FCC1/HN株Pf332基因片段大小为1260bp,编码420个氨基酸残基。恶性疟原虫FCC1/HN株与3D7、Palo Alto株间Pf332基因片段编码的氨基酸残基中分别有1个、15个位点不同。结论 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取Pf332基因片段,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-Pf332;FCC1/HN与3D7株间比FCC1/HN与Palo Alto株间的Pf332基因序列的同源性高。     

恶性疟原虫海南株Pfs40基因原核表达载体的构建和序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1/HN）株膜相关钙结合蛋白（Pfs40）基因编码区的原核表达载体,测定Pfs40基因编码区的序列,了解该虫株与其它虫株Pfs40基因序列的差异。方法 根据Pfs40基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pfs40基因编码区;EcoRV酶切鉴定PCR产物;将Pfs40基因插入原核表达载体PET28a,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,于卡那阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切,PCR扩增鉴定;用双脱氧链末端终止法进行测序,应用软件对Pfs40核苷酸及推测氨基酸序列进行分析。结果 PCR扩增获得1032bp的Pfs40基因,EcoRV酶切表明扩增产物正确;重组质粒经双酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子;恶性疟原虫FCC1/HN株与7G89株Pfs40基因核苷酸序列同源性为99.5%,编码氨基酸序列同源性为99.1%。Pfs40理论蛋白质有5个钙结合区EF-hand结构;4个明显的抗原表位区段。结论 从恶性疟原虫基因的DNA中获取Pfs40基因,并成功构建恶性疟原虫FCC1/HN株Pfs40基因编码区的原核表达载体;FCC1/HN株与7G8株Pfs40基因有高度的同源性。     

恶性疟原虫海南株STARP基因真核表达重组质粒的构建及基因结构分析

目的 构建恶性疟原虫海南（RCC1／HN株）STARP基因真核表达重组质粒pcDNA3-STARP;分析STARP基因结构,并了解FCC1／HN株与其它分离株STARP基因序列的差异。方法 根据STARP基因已知序列设计合成两对引物,用PCR技术从RCC1／HN株基因组DNA中扩增两个部分序列重叠的STARP基因片段;将两基因片段分别双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。酶切,PCR扩增鉴定筛选重组质粒阳性克隆;用双脱氧链末端终止法测序,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 分别PCR扩增获得1078bp,1092bp的两个STARP基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确重组质粒;恶性疟原虫FCC1／HN株与T9／96株STARP基因核苷酸序列同源性92．2％;推测编码氨基酸序列同源性为90．9％;在STARP蛋白中部重复区推测有多个明显的抗原表位区段。结论 从FCC1／HN株恶性疟原虫基因组DNA中获取STARP基因,并成功构建真核表达重组质粒pcDNA3－STARP;FCC1／HN株与其它分离株STARP基因有高度的同源性。     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白II基因克隆及测序

目的:比较恶性疟原虫不同分离株组氨酸富集蛋白II( HRPII)基因全编码区核苷酸序列。方法: PCR扩增恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)和越南株(VN)的HRPII基因全编码区, 其产物经HindIII和Bam HI双酶切,定向克隆入pUC19, 采用Sanger 双脱氧链末端终止法测序。结果:FCC1/HN 株和VN 株HRPII基因均为1 020bp, 无内含子, 两者仅10 个碱基不同。FCC1/HN 株HRPII与VN 株、IMTM22 株和Itg2 株间氨基酸同源性分别为98.8% 、92.2% 和98.7% ; 4 株虫体均有拷贝数不等的丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组氨酸-组氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(AHHAAD) 重复序列, 具有相同的信号肽和糖基化位点。4 个分离株HRPII抗原表位相同,位于易曲性较高的5端非AHH 和AHHAAD 重复区。结论: FCC1/HN 株与VN 株的HRPII高度同源,与IMTM22 株和Itg2 株存在序列差异     

恶性疟原虫FCC1/HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。 方法 用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因,大小为1482 bp,编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同,与K1株的同源性高达99.8％,但与人的4型HK的同源性只有23.2％~26.6％。 结论 获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守,但与人的同源性很低,可能是一个潜在的药物靶标。     

恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因的分子克隆及序列分析

目的　了解恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法　PCR扩增恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH基因全编码区 ,产物经EcoRⅠ +SalⅠ酶切后 ,定向克隆至pGEX - 4T - 1表达质粒 ,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序 ,与其它生物LDH进行同源性分析。 结果　成功地扩增了恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH编码基因 ,大小为 95 1bp ,无内含子 ,与Honduras株LDH基因相比 ,两者有 5个碱基不同 ,推导的氨基酸序列有 4个氨基酸残基不同 ,与刚地弓形虫、隐孢子虫和芽孢杆菌的同源性分别为 49.0 6 % (15 6 / 318)、42 .5 8% (132 / 310 )、31.6 1% (98/310 )。与人的LDH -A、LDH -B和LDH -C的同源性分别为 30 .19% (93/ 30 8)、2 9.5 5 % (91/ 30 8)和 33.44 % (10 4/ 311)。结论　FCC1/HN株与Honduras株LDH高度同源 ,疟原虫LDH明显不同于其它生物LDH     

3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的　测定我国恶性疟原虫海南株 (FCC1/ HN)谷氨酸富集蛋白 (GARP)、丝氨酸重复抗原 (SERA)和裂殖子表面蛋白 1(MSA1)基因序列 ,并进行序列分析。　方法　采用 PCR技术从恶性疟原虫 FCC1/ HN株基因组 DNA中扩增 GARP、SERA和 MSA1基因片段 ,分别插入到测序载体上进行测序。应用 DNAstar软件辅助分析 3种抗原基因的结构及 3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。　结果　恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP基因全长 2 2 6 3bp,编码6 82个氨基酸残基 ,谷氨酸占 2 3.6 1% ,包含 5个典型的氨基酸重复序列 ;SERA基因全长 344 8bp,编码 995个氨基酸残基 ,丝氨酸含量为 10 .6 5 % ,包含 1个连续 32个丝氨酸 (S)残基的序列 ;MSA1基因全长 5 0 85 bp,编码 16 94个氨基酸残基 ,MSA1的氨基酸序列符合 MAD2 0型特征。恶性疟原虫 FCC1/ HN株与 3D7、FC2 7株 GARP的序列差异主要集中于 C-末端 ;FCC1/ HN株与 FCR3、3D7、FCBR、Hondulas- 1株 SERA的序列差异主要集中于 N-端。FCC1/ HN株与MAD2 0、3D7、HN1、HN2、FC2 7、RO- 71、RO- 33、CAMP和 Palo- alto株 MSA1的同源性高 ,K1和 WEL L COME株 MSA1的同源性高 ,各分离株 MSA1的序列差异主要处于第 2至 16分区。　结论　了解了恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP、SERA和 MSA1的     

恶性疟原虫海南株AMA-1、Pfs230基因的序列分析

目的　测定恶性疟原虫海南 (FCC1/HN)株裂殖子顶端膜抗原 1(AMA - 1)基因和Pfs2 30基因序列 ,并分别进行序列分析。方法　根据AMA - 1基因已知序列合成一对引物 ,用PCR技术从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中扩增AMA - 1基因 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3 -AMA - 1。根据Pfs2 30基因已知序列合成七对引物 ,分 7段从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pfs2 30基因 ,并分别将扩增片段插入pMD - 18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定克隆的AMA -1、Pfs2 30基因序列 ,应用DNAstar软件辅助进行序列分析和同源性比较。结果　PCR扩增得到恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1和Pfs2 30基因片段。恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1基因全长 186 9bp ,无内含子 ,编码 6 2 2个氨基酸残基 ,不存在氨基酸重复序列 ,相对分子量约 72 0 4 5kDa ;Pfs2 30基因全长 94 35bp ,无内含子 ,编码 314 4个氨基酸残基 ,分子量为36 4 36kDa。恶性疟原虫FCC1/HN株与FC2 7、7G8、CAMP、FCR3、Thai -Tn、3D7、FVO、KF1916、CMP1、HB3、K1和V1株AMA - 1的同源性在 94 9%以上 ,各株间有 5 3个位置相同的氨基酸残基替代位点 ,并且发生替代的氨基酸残基具二态性。FCC1/HN株分别比 3D7、7G8株Pfs2 30抗原多 9、10个氨基酸残基 ,三个分离株有 2 8个氨基酸替换     

恶性疟原虫FCC1/HN株丙酮酸激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的　扩增恶性疟原虫海南株FCC1/HN的丙酮酸激酶 (PK)的编码基因 ,构建其原核和真核表达重组质粒 ,测定其序列 ,并了解它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫 3D7和人PK基因之间的差异。　方法　根据 3D7的PK基因设计合成一对引物 ,用PCR从FCC1/HN株基因组中扩增PK基因 ;将它分别定向克隆到原核表达质粒PGEX 4T 1和真核表达质粒 pcDNA3 ,分别转化大肠杆菌JM 10 9感受态细菌 ;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆 ,用双脱氧链末端终止法测定其序列 ,用生物信息学软件分析PK序列及进行同源性比较。　结果　PCR扩增得到特异的FCC1/HN株PK基因 ,大小为 2 2 3 5bp ,编码 744个氨基酸。其氨基酸序列与 3D7的同源性高达 99.9% ,与约氏疟原虫的同源性为 70 .2 % ,但与弓形虫和人的PK的同源性分别只有 2 0 .9%和 2 1.6%～ 2 5 .4%。　结论　从FCC1/HN株基因组中获取了PK基因 ,成功构建了其原核和真核表达质粒 ,并测定了其序列 ;它与 3D7的PK高度同源 ,但与人的PK基因同源性很低 ,可能是一个药物靶标。     

恶性疟原虫海南株CTP基因的克隆测序及序列分析

目的 测定恶性疟原虫（P.f）海南株CTP基因序列,了解该虫株CTP基因序列与其它种类的CTP基因序列的差异,用于药物靶位的筛选。方法 用PCR的方法特异性的扩增CTP基因,并将此基因克隆于测序载体pUC19,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序。结果 我国海南株的CTP基因序列与其它的CTP基因有不同程度的差异。结论 P.f CTP作为潜在的抗疟药物靶值得进一步深入研究。     

恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1、Cg1基因T-A克隆及序列分析

目的　将恶性疟原虫FCC1/HN株 (CQS)Pfmdr1和Cg1全基因编码区克隆入测序载体 ,测定其序列 ,为以后研究其与疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法　利用PCR扩增技术 ,分 3个片段从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中 ,特异扩增Pfmdr1全基因编码序列 ;分 2个片段特异扩增Cg1全基因编码序列。扩增产物经纯化回收后 ,T -A克隆入测序载体 pMD18-T ,转化大肠杆菌 (E coli)JM 10 9,筛选阳性克隆 ,并进行双酶切及PCR扩增鉴定 ,获得阳性重组质粒 ,用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果　CQSFCC1/HN株Pfmdr1基因序列与CQSFc2 7株同源性高 ,全长 4 2 4 8bp ,编码 14 15个氨基酸 ;测得Cg1基因全长为 2 82 0bp ,编码 939个氨基酸 ,存在串联α重复序列。 结论　恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1和Cg1全基因编码序列的测定 ,为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。