体外分离培养大鼠毛囊真皮鞘细胞

目的 :扩增培养纯化的大鼠毛囊真皮鞘细胞。方法 :以新生SD大鼠毛囊为原材料 ,机械法分离真皮鞘 ,胶原酶消化 ,获取毛囊真皮鞘细胞 ,体外培养 ,并免疫组化方法鉴定细胞。结果 :通过消化法成功培养了大鼠毛囊真皮鞘细胞 ,并扩增至第六代。结论 :本方法可以快速高效的获得大量真皮鞘细胞。     

毛囊bulge区神经嵴细胞体外分离培养及生物学特点

目的探讨毛囊bulge区神经嵴细胞的体外生物学特点。方法采用体视显微解剖分离毛囊bulge区组织块,贴壁培养获取神经嵴细胞,通过形态学,结合Sox10,p75,nestin免疫细胞化学,观察神经嵴细胞的生物学特点。结果分离培养的小鼠毛囊神经嵴细胞,其形态类似成纤维细胞,免疫细胞化学检测细胞表型nestin,p75,Sox10均呈阳性表达。结论本研究成功从小鼠触须毛囊分离培养出神经嵴细胞,为进一步利用神经嵴细胞开展组织再生研究奠定了基础。     

毛囊bulge干细胞培养方法的比较研究

目的通过对限定性角质形成细胞无血清培养基（DK-SFM）和3T3滋养层培养毛囊bulge干细胞的比较,寻求既能方便获得大量毛囊bulge干细胞,又能减少其分化的理想培养条件。方法采用DK-SFM和3T3滋养层分别培 养毛囊bulge干细胞,通过倒置显微镜观察毛囊bulge干细胞的形态,免疫荧光染色检测毛囊bulge干细胞的特异性标 记细胞角蛋白19（CK19）和分化相关抗体群34（CD34）的表达鉴定毛囊bulge干细胞。通过比较2种方法培养的毛囊bulge干细胞的克隆形成率和CD34阳性率的差异,分别比较毛囊bulge干细胞的增殖能力和干细胞的数量,综合评估 2种培养方法的优劣。结果倒置显微镜观察2种培养方法所得毛囊bulge干细胞均为铺路石状。免疫荧光染色检测 2种培养方法培养的毛囊bulge干细胞CK19和CD34均呈阳性。DK-SFM和3T3滋养层培养的毛囊bulge干细胞克隆形成 率分别为69.4%和62.2%。流式细胞仪检测DK-SFM培养的毛囊bulge干细胞中CD34阳性率为72.3%;3T3滋养层培养 的毛囊bulge干细胞中CD34阳性率为34.7％。结论DK-SFM和3T3滋养层培养作为毛囊bulge干细胞的2种培养方法, 均可以获得未分化的毛囊bulge干细胞。用3T3滋养层培养毛囊bulge干细胞的方法比较复杂,且所获的细胞混杂有 3T3细胞,但用此种方法可获得大量的毛囊bulge干细胞。用DK-SFM培养毛囊bulge干细胞方法简单,但细胞不易贴 壁,且数量较少,但能有效分离出较纯的毛囊bulge干细胞,保持较好的细胞活性。     

小鼠毛囊来源间充质干细胞体外诱导成骨的实验研究

目的:探索便捷而有效的小鼠毛囊来源间充质干细胞的体外培养方法,并研究该群细胞的成骨能力,以探寻新的骨组织工程种子细胞。方法:采用酶消化法分离获得小鼠毛囊来源的干细胞,用不同培养体系进行传代培养,观察各细胞的增殖能力,并对所获得的毛囊来源的干细胞向成骨细胞诱导,行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,对该细胞的成骨能力进行鉴定。结果:应用MEF条件培养液培养的小鼠毛囊来源的间充质干细胞具有较强的增殖能力,且诱导组和对照组能在体外被诱导成骨。结论:小鼠毛囊中存在具有较强增殖能力及成骨能力的间充质干细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。     

人类根尖乳头细胞的放射敏感性分析

本研究通过与根尖牙乳头来源细胞（APDCs）相比，鉴定其中干细胞／祖细胞的放射学特性。方法：从新鲜拔除的具有未成熟根尖的人类第三磨牙中分离APDCs，运用神经球培养技术，制备含有大量干细胞／祖细胞成分的多能性细胞团。经1射线照射后，对牙乳头球形成细胞（PSFCs）和APDCs进行放射敏感性和硬组织形成能力分析。     

人牙源性间充质细胞构建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究

目的以复合生长因子的陶瓷化骨和Collagraft为载体建立人牙源性间充质细胞的体内立体培养模型，构建牙本质-牙髓复合体样结构。方法将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于复合同种生长因子的陶瓷化骨和Collagraft复合材料上，将细胞-支架复合物移植到裸鼠皮下，建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型。4周和10周后取材，对移植物进行组织学观察和人牙本质涎蛋白（DSP）的免疫组化染色。结果10周的实验组标本中，植入细胞在复合生长因子支架上形成了较典型的牙本质-牙髓复合体样结构，人DSP在新生牙本质样组织中呈阳性表达。对照组及4周标本中未观察到此现象。结论用人牙源性间充质细胞和复合生长因子的陶瓷化骨或Collagraft支架材料在裸鼠体内可成功构建出牙本质-牙髓复合体样结构。     

人牙根尖乳头细胞的培养及TNF-α对其增殖的影响

目的:体外培养人根尖乳头细胞,研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对其增殖活性的影响,并与同一牙的牙髓细胞进行比较,探讨炎症条件下根尖乳头细胞用于牙本质再生的可行性.方法:取15岁阻生牙患者拔除的根尖未发育完成的第三磨牙,用酶消化法进行根尖乳头细胞和牙髓细胞的培养;将含有不同浓度TNF-α(5、10、50ng/mL)的培养液加入第4代细胞中,MTT法检测其对细胞增殖活性的影响.采用SPSS11.0软件包对实验组和对照组数据进行单因素方差分析.结果:根尖乳头细胞呈梭形、多角形或纺锤形,形似成纤维细胞;根尖乳头细胞较牙髓细胞具有更强的增殖活性;在10ng/mL和50ng/mL浓度时,TNF-α能促进2种细胞的增殖.结论:根尖乳头细胞具有较强的增殖活性,尤其在炎性环境下仍具有较强的增殖活性,可能在年轻恒牙根尖周炎经适当治疗后牙根继续发育中发挥重要作用.     

负压与BMSCs膜片促进细胞定植和体内成骨的探讨

目的:研究经过负压处理的TCP支架材料与细胞复合后的体内成骨能力。方法:将TCP支架材料负压处理,和骨髓基质细胞(BMSCs)细胞共培养一段时间后,成骨诱导2周,电镜下观察支架材料和细胞复合情况。再将该复合物与BMSCS细胞膜片复合,植入到裸鼠皮下,8周后作组织切片,HE染色和Masson染色,观察其体内成骨能力。结果:负压(有细胞)+膜片组异位移植8周后,内部可见大量胶原纤维和成骨纤维,在团块样组织内部可见大量成骨细胞,并有血管形成。对照组仅有个别细胞密集区,胶原纤维和成骨纤维较少。空白组未见类似情况。结论:经过负压+骨髓基质细胞膜片处理的TCP支架材料,在体内有成骨潜能。     

龈乳头鳞状细胞乳头状瘤1例

鳞状细胞乳头状瘤是一种由黏膜复层鳞状上皮发生而来的良性肿瘤,常见于颊、腭、唇和舌部。本文报告1例发生于牙龈乳头的鳞状细胞乳头状瘤,并结合文献对其病因、临床特点以及治疗方法等进行讨论。     

氯化锂对毛囊神经嵴细胞细胞周期影响的研究

目的：研究氯化锂（LiCl）内源性激活小鼠触须垫区毛囊神经嵴细胞（neure crest cells,NCCs）Wnt／β-catenin信号通路对NCCs增殖的影响。方法：流式细胞技术检测不同浓度的LiCl作用不同时间后对NCCs细胞周期的影响;筛选出LiCl刺激NCCs的最佳浓度和时间,利用细胞免疫荧光及蛋白质免疫印迹法检测β-catenin和细胞周期蛋白CyclinDl、CylinEl的表达情况。结果：20mmol／L的LiCl作用24h,NCCs表现出最强的细胞增殖活性。LiCl刺激NCCs后,β—catenin在细胞内含量升高同时在核内积聚,CyclinDl和CylinEl表达量升高。结论：LiCl能够激活Wnt／β-catenin信号通路,促进细胞周期蛋白的表达,从而促进NCCs增殖。     

人牙髓细胞与牙周韧带细胞多向分化能力的比较

目的 比较人牙髓细胞(dental pulp cells,DPC)和牙周韧带细胞(periodontal ligamentcells,PDLC)的多向分化能力,揭示其干细胞成分特征,为开展干细胞介导的生物牙根再生奠定实验基础.方法 酶消化法分离培养人DPC和PDLC,流式细胞术检测STRO-1的表达.诱导细胞成牙本质及成骨分化、成脂分化和成软骨分化,von Kossa染色、抗骨钙素(osteocalcin,OCN)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)免疫组化染色、油红O染色、阿新蓝染色、抗Ⅱ型胶原免疫组化染色以及实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等检测DPC和PDLC的多向分化.结果 DPC和PDLC体外呈克隆样生长,STRO-1阳性率分别是(16.5%±4.2%)和(11.6%±1.1%).100%的DPC和83.3%的PDLC样本可多向分化.细胞诱导分化后,OCN、牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、过氧化物酶体激活物增生受体2(peroxisomal proliferator activated receptorgamma 2,PPARγ2)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,与诱导前相比差异均有统计学意义(P<0.001),DPC和PDLC间OCN和PPARγ2基因上调倍数的差异有统计学意义(P<0.001).结论 人DPC和PDLC的间充质干细胞比例和多向分化能力相似.     

Role of injured endothelial cells in the recruitment of human pulp cells

In restorative dentistry, deep cavity preparation may lead to partial destruction of the odontoblastic layer. However, newly formed odontoblast-like cells can replace the necrotic odontoblasts and secrete a reparative dentine matrix. While growth factors such as transforming growth factor beta1 (TGFbeta1) and bone morphogenetic proteins (BMP-2 and BMP-4) seem to be involved in the proliferation and differentiation of pulp cells, little is known about the migration of the newly proliferating stem cells to the injury site. Our hypothesis was that endothelial cell injury may be involved in directing these cells towards the injury site. For this study, human pulp fibroblasts and L929 cells were fluorescence-labeled by transduction with the Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP). Similarly, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were labeled with the Discosoma Red Fluorescent Protein-2 (DsRed2). Cell migration was then studied in an insert cell culture system. The HUVEC cells were cultured in the lower compartment while the human pulp fibroblasts or L929 were in the upper compartment. After artificial injury to the HUVEC cells, only human pulp fibroblasts migrated to the lower compartment. At early time periods (4 days), migrating cells were randomly localized on the HUVEC layer. However, after 14 and 20 days, they were perfectly aligned along the injury site. In the absence of injury, no migration was observed. These results suggest that, the endothelial injury is involved in the recruitment of odontoblast-like cells at the injury site.     

人牙周膜干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外定向诱导人牙周膜干细胞分化为神经元样细胞,探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养,筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC）,用含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的预诱导培养液诱导培养24 h,然后换用含5 mmol/L β-巯基乙醇（β-ME）的诱导培养液诱导培养6 h,光镜下观察诱导细胞形态学的改变,免疫荧光、RT-PCR等方法检测鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。同时以未诱导细胞为对照。结果体外诱导培养6 h细胞即发生形态学改变,可看到典型的神经元样细胞;免疫荧光、RT-PCR检测诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE、NF,未诱导细胞无表达。结论人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为神经元样细胞,具有多向分化的潜能。     

牙源性间充质干细胞诱导iPS细胞的效率与时间的研究

目的研究比较不同种牙源性间充质干细胞诱导iPS细胞的效率与时间。方法分离牙髓干细胞（DPSCs）、脱落乳牙干细胞（SHED）、牙乳头干细胞（SCAP）。应用慢病毒介导Lin28、Nanog、Oct4和Sox2因子重编程获得iPS细胞。比较在同等条件下三种细胞获得iPS细胞的克隆数与平均诱导时间。结果DPSC诱导iPS细胞的效率是0.167%,高于SHED细胞和SCAP细胞的诱导效率（0.125%,0.033%）;DPSC诱导iPS细胞的平均重编程时间是20.1d,均少于SHED细胞和SCAP细胞（23.73d,25.25d）,差异均有统计学意义。结论三种不同牙源性细胞有不同的iPS细胞诱导效率与重编程时间,牙髓干细胞有较好的诱导iPS细胞的应用潜能。     

胰岛素样生长因子1诱导外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化

目的：探讨SD大鼠颌突外胚间充质细胞向成牙本质细胞的分化机制。方法：在建立SD大鼠颌突外胚间充质细胞体外培养模型的基础上，用胰岛素样生长因子1(IGF-1)刺激外胚间充质细胞，采用倒置微镜和免疫组化等方法从形态学和功能方面检测细胞的变化。结果：在不含LIF的培养液中加入100ng/mL IGF-1培养的外胚间充质细胞，10d后在倒置显微镜下可见一些细胞出现单一细胞浆突起，似成牙本质细胞。消化后爬片经免疫组化抗DSP染色，部分细胞胞浆呈强阳性着色。结论：IGF-1可部分地诱导外胚间充质细胞向功能性成牙本质细胞分化，可能是牙齿发育过程中的重要细胞因子之一。     

人牙髓干细胞在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的实验研究

目的：探讨矿化液诱导条件下人牙髓干细胞( human dental pulp stem cells,HDPSCs)在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的潜力。方法将HDPSCs接种于钛金属板表面,于第3、7d时观察其增殖状态。将HDPSCs接种于钛金属板表面进行矿化液诱导,于诱导的第0、3、5、7、14、21、28d时,采用RT-PCR检测其牙本质涎磷蛋白( DSPP)、碱性磷酸酶( ALP)、骨涎蛋白( BSP)和骨钙素( OCN)的基因表达。 Western印迹分析、免疫荧光检测BSP及OCN蛋白表达。对照组为矿化液诱导培养皿中的HDPSCs,检测指标、方法基本相同,免疫细胞化学染色检测OCN蛋白表达。结果钛金属板上 HDPSCs增殖迅速,表现出良好的生物相容性。两组细胞均自诱导第3天ALPmRNA呈高表达、DSPP始终不表达。培养皿组BSP、OCNmRNA于第5天开始表达,并随时间延长而表达增高;钛金属组BSP、OCNmRNA表达于第14天出现第一峰值,随后有所下降,28天再次升高。两组BSP蛋白表达趋势与其RT-PCR结果一致,第5天 OCN染色阳性。结论钛金属表面 HDPSCs 经矿化液诱导向成骨细胞样细胞分化。     

人牙源性多能干细胞重编程前后微小RNAs差异表达谱系分析

目的 对比研究两种人牙源性多能干细胞重编程前后微小RNAs（miRNAs）差异表达,交集分析、筛选特异性miRNAs。方法 利用仙台病毒将人牙髓干细胞（DPSCs）和根尖乳头干细胞（SCAP）重编程为诱导性多潜能干细胞（iPSCs）,提取总RNA,miRNAs标记、杂交,扫描芯片、读取图像,筛选差异表达miRNAs,交集分析。结果 人DPSCs和SCAP均可重编程为iPSCs。miRNAs芯片分析结果显示人DPSCs重编程后有68个差异表达miRNAs（倍数>10）,其中37个表达上调,31个表达下调;人SCAP重编程后有107个差异表达miRNAs（倍数>10）,其中68个表达上调,39个表达下调。二者取交集,均上调的有miR-302e,下调的有miR-29b-3p、miR-181b-5p、miR-4328、miR-22-5p、miR-145-5p、miR-4324、let-7b-5p、miR-181a-5p、miR-27b-3p（倍数>10）。结论 人DPSCs和SCAP重编程为iPSCs过程中有多种miRNAs参与,多数与细胞周期、上皮-间充质转化、转化生长因子β信号通路等相关。     

人脐带间充质干细胞诱导为牙周韧带样细胞的实验研究

目的 建立人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cell,hPDLC)与人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUCMSC)体外非接触式共培养模型,研究hUCMSC定向分化为hPDLC的可能性,探索新的可用于牙周组织工程的种子细胞.方法 利用跨室培养装置(Transwell)培养板建屯hPDLC与hUCMSC体外非接触式共培养模型,免疫组织化学方法 检测其骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(ostocalcin,OCN)及骨涎蛋白(bone sialopmtein,BSP)的表达情况,并采用蛋白质印迹法从蛋白水平定量分析诱导后hUCMSC在分子水平的改变.结果 hUCMSC在非接触式共培养体系中可以被hPDLC诱导为多角形或梭形,蛋白质印迹法检测结果 显示,共培养3、7、14及21 d后的hUCMSC在蛋白水平OCN和OPN表达上调[OCN共培养前(0.88±0.21),共培养21 d(1.42±0.17);OPN共培养前(0.93±0.13),共培养21 d(1.43±0.22)];BSP表达逐渐下调[共培养前(1.60±0.09),培养21 d(0.75±0.20)],与共培养前相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 hUCMSC在一定条件下可向hPDLC定向分化,并有望成为牙周组织工程的种子细胞.     

非内皮细胞在血管瘤生长周期中的作用

血管瘤是婴儿和青少年常见的肿瘤,通常情况下血管瘤的生长可分为增殖期、消退期以及消退完成期。目前多种因素都被证实可以导致血管瘤血管内皮细胞的异常增殖,本文从非内皮细胞的角度,总结了近年的研究成果,探讨血管瘤发生发展的机制。     

小鼠胚胎干细胞向成牙本质样细胞的诱导分化

目的探讨胚胎干细胞(ES细胞)向成牙本质样细胞诱导分化的方法。方法首先通过悬浮培养的方式,将ES细胞诱导分化形成拟胚体,然后将拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞通过Transwell培养系统共培养,研究拟胚体细胞向成牙本质样细胞的分化情况。结果RT-PCR结果显示,拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞共培养10d后,可检测到成牙本质细胞的特征性分子——牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达;共培养15d后,表达有所增强。而单独培养的拟胚体细胞,则始终未检测到DSPP的表达。结论通过与牙髓成纤维细胞共培养,可以促进胚胎干细胞向成牙本质样细胞分化。