随着饮食习惯和生活方式的改变，糖尿病的发病率显著上升。WHO预测到2030年全球将有超过5亿人患糖尿病^[1]。高血糖是糖尿病的主要临床特征之一。高血糖导致包括心脏、肾脏、眼底和神经系统等^[2]各种糖尿病并发症。糖尿病心肌病引发的心脏重塑是糖尿病患者死亡的重要原因，尽管临床上各种抗心衰药物广泛使用，每年仍有大量患者死于糖尿病诱发的心力衰竭^[3]。因此，通过探索糖尿病心肌病的发病机制、寻找能够缓解糖尿病心肌病的新型药物成为近期研究的热点与难点。

褪黑素（melatonin，Mel）是一种由脑松果体合成的内源性吲哚胺激素，具有抗炎、抗氧化等生理作用。近期研究发现，Mel可能在心血管疾病的发生发展中发挥保护性作用^[4,5]，但Mel在糖尿病心肌病发生发展中的作用与机制尚未完全阐明。

本研究通过分离、培养乳鼠原代心室肌细胞，观察高糖对原代心肌细胞凋亡的影响；进一步明确Mel在高糖诱发心肌细胞损伤中的作用及其机制。为临床上寻找针对糖尿病心肌病治疗的药物靶点提供新的理论依据。

1.   材料和方法

1.1   材料

Caspase-9（phospho Thr125）, Polyclonal Antibody，购买自ImmunoWay Biotechnology, USA公公司（Catalog No：YP0598）；Anti-pan-AKT（phospho T308）抗体购买自ABCAM, UK公司（ab8933）；Cleaved-Caspase-3 购买自ABCAM, UK公司（ab2302）；β-actin抗体购买自Proteintech, China公司（66009-1-lg）；PI3K p85购自ABCAM（ab191606）；胎牛血清为ExCell FCS500、TUNEL试剂盒为Roche, Switzerland公司的In Situ Cell Death DetectionKit；兔源性的荧光二抗FITC和Cy3购买自Boster,China公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购买自西安壮志公司（EK020）。PI3K/AKt抑制剂LY294002为西安晨诺生物公司分装，其原始货号为：HY-10108, MCE, USA, 使用浓度为50 μmo/L；（1-2）d的新生乳鼠购买自空军军医大学实验动物中心；Melatonin购买自MCE公司, 货号为HY-B0075，使用浓度为30 μmo/L^[4,5]

1.2   方法

1.2.1   乳鼠原代心肌细胞的分离培养和实验分组

取出生（1-2） d的新生C57BL/6乳鼠的心室、分离原代心肌细胞。用预冷的磷酸盐缓冲盐溶液中洗涤乳鼠左心室组织以清除表面血迹。将剪成1 mm³大小的碎块状的心室组织放入锥形瓶中，根据组织量加入胶原酶1。放入37 ℃水浴中消化，第一次消化后吸弃上清液。以后每次消化后充分重悬，放置沉淀后收集上清液，将每次收集到的上清液加入等体积的含有100 ml/L胎牛血清的DMEM 培养液中，轻轻吹打制成细胞悬液，收集到无菌离心管中，重复多次，直至心肌组织块消失。将无菌离心管中的细胞悬液离心后弃去上清，用100 ml/L胎牛血清的DMEM 培养液再次重悬细胞，用细胞筛网过滤悬液，分装入细胞培养瓶中。将其分为4组：正常葡萄糖浓度对照（Control）组、高糖（HG）组、HG+Mel组、HG+Mel+LY294002组。

1.2.2   Cl-Caspase3和Caspase9 mRNA表达的RT-PCR检测

RT-PCR 引物由武汉的Servicebio公司设计并合成，相关引物序列：Caspase9正向引物GACGCTCTGCTGAGTCGAG，反向引物GGTCTAGGGGTTTAACAGCCTC；β-actin正向引物GGCTGTATTCCCCTCCATCG，反向引物CCAGTTGGTAACAATGCCATGT；Caspase3正向引物TGGTGATGAAGGGGTCATTTATG，反向引物TTCGGCTTTCCAGTCAGAGACTC；Akt正向引物ATGAACGACGTAGCCATTGTG，反向引物TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT。参照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒和说明书，数据处理采用2^−ΔΔct法。

1.2.3   Cl-Caspase3和Caspase9蛋白的Western Blot 检测

取弃去细胞培养瓶中的培养基并用预冷的PBS清洗乳鼠原代心肌细胞，加入含PMSF（l mmol/L，pH=7.4）的蛋白裂解液在冰上研磨使其充分裂解，12 000 r/min离心20 min。取上清，BCA法对蛋白质进行定量。Western Blott法检测相关蛋白的表达。具体方法：取20 μg总蛋白样品于100 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印至PVDF膜，脱脂牛奶封闭，一抗 Cl-Caspase3或者Caspase9按照1:100的比例稀释，以4 ℃孵育过夜，加HRP标记的山羊抗兔二抗abbkine HRP Goat Anti-Rabbit lgG，以1：3000比例稀释，室温孵育60 min，显色。β-actin作为内参。目的条带和β-actin的信号面积之比评定蛋白表达水平。

1.2.4   心肌细胞胞内p-Akt表达的免疫荧光检测

取培养乳鼠原代心肌细胞的激光共聚焦皿，弃去培养基，用无菌PBS冲洗，加入 1:200 稀释的Anti-pan-AKT (phospho T308)，4 ℃孵育过夜。BSA封闭2 h，随后二抗（山羊抗兔lgG H&L, FITC/Cy3，Boster Biological Technology；BA1101/BA1103）孵育1 h。抗荧光淬灭剂封片。在Olympus FV1000激光共聚焦显微镜（奥林巴斯，日本）下观察细胞并拍片记录，利用Image J软件（national institutes of health）对荧光信号进行后续分析。

1.2.5   高糖诱导的心肌细胞TUNEL凋亡检测

培养乳鼠原代心肌细胞的激光共聚焦皿予以40 g/L多聚甲醛固定，根据凋亡试剂盒（Roche,Germany）的说明书进行后续操作。抗荧光淬灭剂封片后在激光共聚焦显微镜(Olympus FV1000）下观察并拍照。凋亡的核为深绿色，同蓝色的核（采用DAPI染色）可以部分或者完全的重叠（Merge）。

1.3   统计学处理

采用GraphPad Prism统计学分析，本实验数据为连续性的计量资料，统计两组间差异采用未配对的t检验完成，采用$\bar{x}$±SEM表示，采用Two-sided tests，P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   Mel对高糖诱导的心肌细胞凋亡的影响

Western Blot 结果显示，25 mmol/L高糖干预引起乳鼠原代心室肌细胞胞浆内Caspase9和 Cl-Caspase3的蛋白表达显著升高（P<0.05）,30 μmol/l Mel明显缓解高糖诱导的心肌细胞Caspase9、Cl-Caspase3蛋白表达的升高（P<0.05），加入Akt通路的抑制剂LY294002后心肌细胞胞浆内Caspase9、Cl-Caspase3蛋白表达较Mel组升高（P<0.05）；RT-PCR结果显示：25 mmol/l高糖干预引起心肌细胞胞浆内Caspase9和Cl-Caspase3的mRNA表达水平显著升高（P<0.05），30 μmol/l Mel可以有效缓解高糖诱导的心肌细胞Caspase9、Cl-Caspase3的升高（P<0.05），该保护效应被Akt通路的抑制剂LY294002所阻断（P<0.05）；TUNEL结果显示：25 mmol/l高糖干预引起原代心肌细胞凋亡，表现为绿核/蓝核比例的显著升高（P<0.05），30 μmol/l Mel可以显著缓解高糖诱导的心肌细胞凋亡（P<0.05），该抗心肌细胞凋亡效应被Akt通路的抑制剂LY294002阻断（P<0.05），见图1。

图  1  Mel对高糖诱导乳鼠原代心肌细胞的影响

1：Control组；2：HG组；3：HG+Mel组；4：HG+Mel+ LY294002组。n=6～15。与Control组比较，^aP<0.05；与HG组比较，^cP<0.05；与HG+Mel组比较，^eP<0.05

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2.2   Mel通过激活Akt通路抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡

Western Blot结果显示，25 mmol/L高糖干预引起乳鼠原代心肌细胞胞浆内Akt蛋白Thr308位点的磷酸化较对照组降低（P<0.05），该效应可被30 μmo/L的Mel干预所阻断（P<0.05），加入Akt通路的抑制剂LY294002后心肌细胞胞浆内Akt蛋白的磷酸化较Mel组显著降低（P<0.05）；RT-PCR结果显示：25 mmol/l高糖干预引起心肌细胞胞浆内Akt的mRNA表达水平降低（P<0.05），该效应可被30 μmol/l Mel干预所阻断，加入Akt通路的抑制剂LY294002后心肌细胞胞浆内Akt的mRNA表达较Mel组显著降低（P<0.05）；免疫荧光双标实验提示：25 mmol/l高糖干预抑制心肌细胞Akt蛋白Thr183位点的磷酸化，表现为每个心肌细胞胞浆内的平均绿点（代表Akt蛋白Thr183位点的磷酸化）数目显著减少（P<0.05），该效应可被30 μmol/l Mel干预所阻断（P<0.05），加入Akt通路的抑制剂LY294002后心肌细胞Akt蛋白Thr183位点的磷酸化较Mel组显著降低, 表现为心肌细胞胞浆内绿点（代表Akt蛋白Thr183位点的磷酸化）较Mel组明显减少（P<0.05），见图2。

图  2  Mel通过激活Akt通路抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡

1：Control组；2：HG组；3：HG+Mel组；4：HG+Mel+ LY294002组。n=6～20。与Control组比较，^aP<0.05；与HG组比较，^cP<0.05；与HG+Mel组比较，^eP<0.05

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2.3   Mel调控Akt(Thr308）的上游分子是PI3K p85

Western Blot结果显示：高糖干预引起乳鼠原代心肌细胞胞浆内的PI3K p85蛋白表达较对照组降低（P<0.05），该效应可被30 μmo/L的Mel干预所阻断（P<0.05），加入PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002后心肌细胞PI3K p85较Mel组显著降低（P<0.05）,实验结果，见图3。

图  3  Mel激活Akt (Thr308)的上游分子是PI3K p85 1：Control组；2：HG组；3：HG+Mel组；4：HG+Mel+ LY294002组。n=6。与Control组比较，^aP<0.05；与HG组比较，^cP<0.05；与HG+Mel组比较，^eP<0.05

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3.   讨论

糖尿病心肌病是一种由糖尿病诱发心肌损伤所导致的心肌病理改变，早期表现为心肌细胞代谢异常，代谢异常促进心脏重塑和左室舒张期功能障碍，最终进展为终末期心力衰竭^[6]。近期研究表明：高血糖是糖尿病心肌病发生、发展的独立危险因素^{[7, 8]}。这可能由于高血糖引起蛋白糖基化，导致心肌糖基化终末产物（AGEs）堆积，进一步诱发心肌线粒体功能障碍，最终导致心脏重塑^[9]。国外研究亦发现：糖尿病患者长期的高血糖状态诱导心肌细胞凋亡^[10]。本研究通过TUNEL、RT-PCR以及Western Blotting等实验也表明：高糖处理的原代心肌细胞凋亡指标相比于对照组显著升高。综合以上研究，我们认为：高糖诱发心肌细胞凋亡是导致糖尿病心肌病发生、发展的重要因素。

由于心肌细胞难以再生，其持续的凋亡最终导致凋亡性心肌病发生^{[11, 12]}。因此，寻找针对凋亡信号通路的新型药物抑制心肌细胞凋亡以缓解糖尿病心肌病的进展成为治疗糖尿病心肌病的关键。

Akt信号通路在心肌葡萄糖代谢中发挥重要作用，其可能参与糖尿病的发生发展^[13]。Akt信号通路也是调控心肌细胞凋亡的重要通路^[14]。有研究发现：Akt通路通过介导葡萄糖转运蛋白（GLUT）4膜易位缓解小鼠糖尿病心肌病的进展^[15]。本研究也发现：高糖抑制Akt信号通路、诱发乳鼠原代心肌细胞凋亡。

我们进一步的研究结果显示：Mel可以改善高糖诱导的原代心肌细胞凋亡。有趣的是，Mel缓解心肌细胞凋亡伴随Akt信号通路的激活；更重要的是，本课题发现：采用Akt通路的抑制剂LY294002抑制Akt，Mel缓解高糖诱发心肌细胞凋亡的保护性效应随之消失。这表明：Mel缓解高糖诱导心肌细胞凋亡的作用是通过激活Akt通路来实现的。

在经典通路中：PI3K p85通过磷酸化Akt Thr308位点发挥生物学功能。本研究发现Mel调控的靶点也是Akt Thr308；而且Mel对抗高糖诱导的乳鼠原代心肌细胞PI3K p85蛋白的下调，该作用可被PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002所阻断。因此，Mel调控Akt Thr308是通过经典的PI3K p85/Akt Thr308通路实现的。本研究的机制通路，见图4。

图  4  本研究的机制通路图

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综上，本课题发现：Mel通过激活Akt通路缓解高糖诱发的心肌细胞凋亡。未来，通过Mel调控心肌Akt通路可能成为糖尿病心肌病治疗的新手段与靶点。

局限性：本课题为离体研究。以本研究为基础，后续拟针对Mel在小鼠糖尿病心肌病发展中的作用和机制进行更深入的在体研究。